1、氨甲酰磷酸合成酶单克隆抗体的制备、 鉴定及应用【摘要】 目的: 制备抗人氨甲酰磷酸合成酶(CPSI)的单克隆抗体（mAb）并进行初步鉴定与应用。方法: 将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体, 用线粒体总蛋白免疫 BALB/c 小鼠, 采用杂交瘤技术制备 mAb, 并通过间接 ELISA 法、 Western blot、 免疫组化及免疫荧光染色的方法对 mAb 进行特性鉴定, 通过免疫沉淀联合质谱、 UniZAP XR 表达文库筛选鉴定抗原, 借助免疫捕获的方法用抗体来分离复合物。结果: 获得 3 株可稳定分泌抗人 CPSI mAb 的杂交瘤细胞系。mAb 的 Ig 亚类(型)为 IgG1（）,
2、 该 mAb 可用于 ELISA 检测、 Western blot、 免疫组化、免疫荧光染色、 免疫沉淀实验和复合物的分离。结论: 成功制备了抗人 CPSI 的 mAb, 为 CPSI 的研究提供了有力的工具。 【关键词】 氨甲酰磷酸合成酶(CPSI) 单克隆抗体 特性氨甲酰磷酸合成酶（human carbamyl phosphate synthetase 1, CPSI/EC 6.3.4.16）是肝脏细胞能量代谢中尿素循环中的关键酶, 而尿素循环的代谢途径为肝脏细胞线粒体的一项主要功能, 氨甲酰磷酸合成酶可以去除细胞中多余的氨, 此酶缺失可以导致高氨血症。我们在成人肝脏线粒体单克隆抗体(mA
3、b)库的建立中, 应用线粒体总蛋白免疫 BALB/c小鼠制备 mAb, 获得 3 株鼠抗人 CPS1 mAb, 并对其特异性进行了鉴定。这为进一步研究 CPS1 在代谢中的作用提供参考。1 材料和方法1.1 材料 免疫和筛选用成人肝组织线粒体总蛋白, 由本室制备; 弗氏佐剂购自 Sigma 公司; 羊抗鼠 IgGHRP 购自中山公司 ; 蛋白酶抑制剂购自Roche 公司; HiTrapTM Protein G HP 抗体纯化柱购自 Amersham 公司; BCA 蛋白定量试剂盒购自 Pierce 公司; PVDF 膜购自 Amersham 公司; ECL 反应试剂盒购自 Amersham 公
4、司; 半干转印仪购自 BioRad 公司; DY89 型电动玻璃匀浆机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。1.2 方法1.2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备 成人肝组织匀浆 700750 r/min, 10 g 组织加 40 mL 匀浆缓冲液800 g 离心 10 min, 取上清, 10 000 g 离心 10 min, 沉淀即为线粒体, 用匀浆缓冲液洗 2 次。用 RIPA 裂解液裂解线粒体样品, 离心后取上清, 获得线粒体总蛋白。采用 BCA 法测定蛋白浓度, 计算线粒体的得率, 通过测定匀浆液和分离的线粒体中的琥珀酸脱氢酶的活性计算线粒体的富集度, SDSPAGE 鉴定抗原的相对分
5、子质量(Mr)。1.2.2 鼠抗人 mAb 的制备将线粒体总蛋白 1 mg 与等体积弗氏完全佐剂混合后进行充分乳化, 多点皮下注射。首次免疫后 4 周加强免疫 1 次, 1 周后经尾静脉取血, 分离血清, ELISA 法测定效价。融合前 3 d 进行加强免疫, 取小鼠脾细胞与X653 细胞进行细胞融合, 采用杂交瘤技术制备 mAb。1.2.3 抗原的鉴定(1)抗原的质谱鉴定: 应用 mAb 从线粒体总蛋白中免疫沉淀抗原, 并进行 SDSPAGE 电泳, 根据 Western blot 结果显示的阳性条带, 从 SDSPAGE 胶上切下相应的条带, 酶切, 质谱鉴定。(2)抗原的 UniZAP
6、XR 表达文库筛选鉴定: 取大肠杆菌 XL1BLUE MRF过夜培养菌接种于 LB 培养液中, 37震荡培养至 A600 为 0.7 左右, 3 000 r/min 下离心 10 min, 用 10 mmol/L 的硫酸镁重悬细菌沉淀至 A600 为0.5, 取适当稀释的文库 60 L(含约 50 000 个噬菌体)与 600 L 重悬的 XL1BLUE MRF混匀后 37温育 20 min, 铺至 150 mm 的 NZYLB 平板上, 42倒置培养至噬菌斑模糊可见, 将浸泡过 IPTG 的 NC 膜覆盖表面, 37继续培养 3.5 h, 用防水墨水定位后 , 剥离滤膜, 进行常规 Dot
7、blot 检测。在原位板上回收阳性克隆, 用 ExAssist 辅助噬菌体进行体内剪切、 测序及 Western blot 分析。1.2.4 mAb 的鉴定 (1)Western blot 分析: 线粒体总蛋白经 SDSPAGE 后, 电转至PVDF 膜上。用 50 g/L 脱脂奶粉室温下封闭 1 h, 然后加入 12 000 稀释的 mAb, 室温下孵育 2 h, TBST 缓冲液洗膜后, 加入羊抗鼠IgGHRP 抗体（15 000 稀释）, 室温下孵育 1 h, TBST 缓冲液洗膜后, ECL 法显色。(2)免疫组化鉴定: 用丙酮固定的冰冻成人肝组织切片, PBST 浸洗 3 min 后
8、每个组织片滴加 25 mg/L 的 Avidin 50 L, 室温孵育 15 min, 滴加 H2O2 甲醇, 室温孵育 15 min。滴加正常羊血清室温下封闭 20 min, 加入 1100 稀释的鼠抗人 CPS1 mAb, 4孵育过夜。PBS洗片后加入羊抗鼠 IgGHRP, 37孵育 30 min, PBS 洗片后进行 DAB 显色, 苏木素复染, 返蓝后封片。(3)免疫荧光染色: 取 liver carcinoma cells (HCV)细胞, 用 2.5 g/L 胰蛋白酶消化, 制成单细胞悬液, 将细胞接种到预先放置盖玻片的培养皿中, 置 50 mL/L CO2, 37孵箱中培养13
9、d, 待细胞接近长成单层, 加入适当稀释的罗丹明 123, 置 50 mL/L CO2, 37孵箱中培养 30 min, 取出盖玻片, 浸入 PBS（0.01 mol/L, pH7.4）, 洗 2 次。40 g/L 多聚甲醛（1 g/L Tween20）固定 5 min。将已固定的细胞玻片用 PBS 振洗 5 min, 取出吹干。加羊血清封闭 37, 30 min。滴加适当稀释的特异抗体（线粒体蛋白 mAb）, 置湿盒内, 37保温 30 min。TBST 振洗 3 次。滴加适当稀释的荧光素抗体（罗丹明标记山羊抗小鼠 IgG） （Rhodamine（TRITC）conjugated Affin
10、iPure Goat AntiMouse IgG(H+L), 37保温 30 min。TBST 振洗 3 次, 蒸馏水振洗1 次。50 mL/L 缓冲甘油封片, 荧光显微镜观察, 拍照。1.2.5 mAb 的应用 抗体用于复合物的分离, 取成人肝脏组织线粒体加入 20 g/L ndodecylDmaltoside, 冰浴 30 min, 180 000 g离心 30 min, 取上清 A。将 25 mmol/L dimethylpimelimimidate, BEH045 mAb, ProteinG, 混合 30 min。3 000 r/min, 离心 1 min, 弃上清, 加入 0.2 m
11、ol/L 乙醇胺, 混合 3 h。3 000 r/min, 离心 1 min, 弃上清, 加入 1 mL 磷酸盐缓冲液重悬沉淀, 加入上清 A, 4混合过夜。3 000 r/min, 离心 1 min, 弃上清, 沉淀用磷酸盐缓冲液加入 0.5 g/L ndodecylDmaltoside 洗 6 次。用 2 倍柱体积的 0.1 mol/L 甘氨酸洗 2 次, 离心后取上清。上清用 Mr 为 3 500 超滤管超滤浓缩, 用于一维、 二维电泳。2 结果2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备 通过差速离心方法分离线粒体, 每克肝组织可得到 810 mg 线粒体蛋白。通过测定琥珀酸脱氢酶活性并计
12、算线粒体富集度, 多次结果显示为线粒体富集度为 47 倍。成人肝组织线粒体总蛋白经 SDSPAGE, 显示其 Mr 主要分布在 25 00075 000 之间, 与文献报导一致1, 可作为免疫动物的抗原。2.2 鼠抗人 mAb 的制备及初步鉴定 应用细胞融合、 筛选和克隆化, 共获得 23 株抗人肝脏线粒体阳性的细胞株。其中 1 株 BEH045 经 ELISA 检测效价约为 1128 000, 其亚类（型）为 IgG1（） 。2.3 抗原特异性鉴定 (1)抗原的质谱鉴定: IP 和 Western blot 结果显示。在 23 株杂交瘤细胞中, BEH045 可特异识别成人肝组织中 Mr 约
13、为 160 000 的蛋白（图1） 。应用 BEH045 mAb 从线粒体总蛋白中免疫沉淀相应的抗原, 并进行SDSPAGE 电泳, 从 SDSPAGE 胶上切下 Mr 约为 160 000 的蛋白, 质谱鉴定结果为氨甲酰磷酸合成酶。(2)抗原的 UniZAP XR 表达文库筛选鉴定: 用获得的 BEH045 的细胞培养上清对肝脏 cDNA 表达文库进行筛选, 以 50 000 个克隆的密度铺板, 筛选阳性克隆, 分离独立的阳性克隆进行体内剪切和测序。测序结果表明, BEH045 识别的蛋白为 CPSI, Mr 为 160 000, 与免疫沉淀结果一致。为了进一步证明筛选的可靠性, 又对分离到
14、的阳性克隆进行了 Western blot 鉴定。结果显示, 抗体 BEH045 与诱导后的细菌总蛋白有特异的反应条带, 位于 Mr 约为 160 000 处, 与用pBlueScript SK 载体构建 cDNA 文库进行融合表达的蛋白 Mr 一致。因此, BEH045 识别的蛋白为 CPS12 。2.4 mAb 的免疫组化鉴定 免疫组化结果显示, 鼠抗人 CPS1 mAb 所识别的分子位于肝细胞的胞质（图 2） 。2.5 mAb 的亚细胞定位 免疫荧光染色结果显示, 鼠抗人 CPS1 mAb 所识别的分子位于肝细胞的线粒体（图 3） 。2.5 mAb 分离复合物 借助免疫沉淀的方法, 应用
15、 BEH045 mAb 分离相应抗原及抗原相关蛋白质, 从电泳图中可以看出有多条蛋白质条带（图 4）, 而 Western blot 结果显示 BEH045 mAb 识别的蛋白质 Mr 在 160 000 左右, 那么未被BEH045 mAb 识别的蛋白质有可能是 BEH045 mAb 识别的蛋白质 CPS1 复合物的组成部分或相关蛋白质。将 BEH045 mAb 捕获的蛋白质进行双相电泳, 胶上蛋白质酶切, 质谱分析, 结果鉴定出 7 种蛋白质（human carbamy1 phosphate synthetase I, 78 000 glucoseregulated protein pre
16、cursor, nonspecific lipidtransfer protein mitochondrial precursor, protein disulfide isomerase A3 precursor, argininosuccinate synthase, stress70 protein mitochondrial precursor, hypothetical protein DKFZp686J18235） 。这些酶与葡萄糖代谢中的尿酸循环、 TCA 循环、 氨的代谢和脂类代谢有关。3 讨论本研究旨在分离人肝脏细胞线粒体, 用总蛋白免疫小鼠, 并进行了 3 次细胞融合, 共
17、获得了 23 株杂交瘤细胞株。所获得的抗体中有 3 株（MBEH045、 MAAD309、 MBFG021）是针对 CPS1 的 mAb。Western blot结果显示抗体识别的蛋白 Mr 在 160 000 左右。CPSI 由位于染色体 2q35 的 CPSI 基因编码。人 CPSI 基因有120 000 的基因组 DNA, 有 38 个外显子和 37 个内含子。CPSI 的前体（165 000）在胞质中合成, 而后转运到线粒体裂解为成熟的酶（160 000） 3 。CPSI 活性的调节依赖于 N 乙酰谷氨酸的水平。CPS1 是尿酸循环的一个酶, 特异地表达于肝脏的线粒体和小肠的内皮细胞4
18、 。CPS1 缺失可引起尿酸循环障碍导致高氨血症5 。CPSI 缺失(CPSID)为常染色体隐性遗传, 表现为婴儿期破坏性的代谢疾病或晚期更严重的发作。氨甲酰磷酸合成酶的单克隆抗体有可能研制成为特异识别氨甲酰磷酸合成酶的试剂从而为临床诊断与治疗提供帮助。CPSI 在体内是以复合物的形式存在的。以往的研究结果表明 CPS1与线粒体中天冬氨酸氨基转移酶能够形成复合物, 但与尿酸循环中其他酶的关系尚未充分阐明。因此对于将来更好地研究 CPS1 复合物的结构和功能, 更充分地了解尿酸循环的分子机制 , BEH045 mAb 是一个很好的工具。抗体捕获组分的分析有助于蛋白质复合物及其相互作用的研究, 也
19、在新的蛋白质发现和确认方面提供重要信息和证据。【参考文献】1Mootha V, Bunkenborg J, Olsen J, et al. Integrated analysis of protein composition, tissue diversity, and gene regulation in mouse mitochondriaJ. Cell, 2003, 115（5）: 629-640.2Gao J, Gao Y, Ju Y, et al. Proteomicsbased generation and characterization of monoclonal antibo
20、dies against human liver mitochondrial proteinsJ. Proteomics, 2006, 6(2): 427-437.3Summar ML, Hall LD, Eeds AM, et al. Characterization of genomic structure and polymorphisms in the human carbamyl phosphate synthetase I geneJ. Gene, 2003, 311: 51-57.4 Funghini S, Donati MA, Pasquini E, et al. Struct
21、ural organization of the human carbamyl phosphate synthetase I gene (CPS1) and identification of two novel genetic lesionsJ. Hum Mutat, 2003, 22(4): 340-341.5Pearson DL, Dawling S, Walsh WF, et al. Ureacycle intermediates, nitric oxide production, and carbamoylphosphate synthetase functionJ. N Engl J Med, 2001, 344(24): 1832-1838.ISSN1007-8738 细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2008, 24(5)论著
