1、白花蛇舌草对正常器官氧化损伤防护效应的实验研究【摘要】 目的 探讨白花蛇舌草对经抗肿瘤药物治疗的荷瘤小鼠正常器官氧化损伤的防护效应及机制。方法荷瘤鼠随机分为 3 组：对照组，不给予任何治疗继续饲养至实验结束；单纯化疗组，单次腹腔注射顺铂（DDP）或阿霉素（ADM） ；化疗+白花蛇舌草组，单次腹腔注射 DDP 或ADM，并给予白花蛇舌草水煎液灌胃，连续应用 7 天。 化学比色法测定荷瘤小鼠肝脏、脾脏、肾脏和骨髓组织的活性氧（ROS） 、丙二醛（MDA）水平和谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px） 、过氧化氢酶（CAT）活性，电镜下观察脾脏超微结构变化。结果 化疗+白花蛇舌草组小鼠肝、脾和骨髓组织的 R
2、OS、MDA 水平和 GSH-Px、CAT 活性较单纯化疗组明显降低（P0.01） ，脾脏超微结构变化明显减轻。结论 白花蛇舌草具有抗氧化损伤作用，可减轻化疗药物引起的荷瘤鼠正常器官的副损伤。 【关键词】 白花蛇舌草 脾 活性氧 丙二醛 谷胱甘肽过氧化酶 过氧化氢酶 Abstract: Objective To study the effect of Hedyotic diffusa on the oxidative injury of the normal tissues induced by antitumorous drugs in tumor-bearing mice. Methods
3、 The contents of reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde(MDA) and the activities of glutathione peroxidase (GSH-Px) and catalase (CAT) in tissue homogenates were determined by chemocolorimetry. Electron microscope was used to study the ultrastructure of spleen. Results Hedyotic diffusa red
4、uced the activities of GSH-Px and CAT and reduced the contents of ROS and MDA in the normal tissues of tumor-bearing mice treated with chemotherapy. Hedyotic diffusa also lessened the ultrastructural injury of spleen. Conclusion Hedyotic diffusa has protective effects against oxidative injury of nor
5、mal tissues induced by antitumorous drugs in tumor-bearing mice. Key words: Hedyotic diffusa; spleen; reactive oxygen species; malondialdehyde; glutathione peroxidase; catalase 抗肿瘤药物可通过刺激肿瘤细胞产生高浓度活性氧（ROS）来诱导细胞凋亡，也可导致机体正常组织的损伤，尤其细胞增殖速率较高或（和）药物代谢所在的组织（骨髓、胃肠上皮、肾脏、肝脏等） ，这些毒副作用限制了抗肿瘤药物用药剂量，或在获得疗效之前不得不中断治
6、疗，将严重影响患者的疗效1 。白花蛇舌草系茜草科耳草属植物，性味苦、甘、寒，含有丰富的有机锗、黄酮、多酚、果酸、多糖等化合物。文献报道白花蛇舌草具有抗氧化作用和增强机体免疫功能的作用2-3 。为此，本实验进行白花蛇舌草对经化疗荷瘤小鼠导致正常器官氧化损伤的防护效应的实验研究，这将为白花蛇舌草制剂临床抗肿瘤治疗提供更多资料。1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 健康 BALB/c 小鼠 30 只，68 周龄，体重（202） g，由上海实验动物中心提供；U14 宫颈癌腹腔积液型，由上海医药工业研究院实验动物中心提供。 1.1.2 药品 白花蛇舌草 200 g 加蒸馏水 2000 ml
7、 温火煎煮 2 h，去渣浓缩为 200 ml 备用。抗肿瘤药物顺铂（DDP） （山东德州制药厂，批号：020902） ，阿霉素（ADM） （浙江海正药业股份有限公司，批号：002204） ，足叶乙甙（VP-16） （江苏恒瑞制药有限公司，批号：021211） 。ROS、丙二醛（MDA） 、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px） 、过氧化氢酶（CAT）测定盒，南京建成生物有限公司。 1.2 方法 1.2.1 肿瘤动物模型的建立 无菌条件下抽取传代荷瘤小鼠的腹腔积液，以生理盐水稀释，调至细胞浓度约 11010/L，取细胞悬液 0.2 ml，于小鼠左腋下皮下接种。小鼠皮下接种肿瘤细胞后 1014 天肿瘤直
8、径约 1 cm 时开始进行分组实验。 1.2.2 动物分组 将已经形成实体瘤的荷瘤鼠随机分为 3 组。对照组：不给予任何治疗继续饲养至实验结束；单纯化疗组：单次腹腔注射 DDP 或 ADM，用药剂量 DDP=2.5kg-11.88鼠重（kg） ，ADM=1.25kg-11.88鼠重（kg） 4 ；化疗+白花蛇舌草组：单次腹腔注射 DDP 或 ADM，同时给予白花蛇舌草浓缩液灌胃，0.5 ml/（次只） ，1 次/d，连续应用 10 天，同时单纯化疗组等量生理盐水灌胃。每组动物为 10 只。 1.2.3 标本处理 荷瘤鼠治疗结束后次日，采用颈椎脱臼法处死小鼠，立即取出其肝、脾、肾，置于预先配制预
9、冷的匀浆介质中，各取组织块约 1 g，加入 9 倍匀浆介质用电动匀浆器高速匀浆使组织细胞破碎，再离心取适量上清液进行各项指标测定。同时取其股骨收集骨髓细胞，加入匀浆介质调细胞浓度为 11010/L，低速匀浆，再离心，同样取适量上清液进行各项指标测定。 1.2.4 化学比色法测定荷瘤小鼠肝、脾、肾和骨髓组织的 ROS、MDA水平和 GSH-Px、CAT 活性。 1.2.4.1 组织 ROS 的测定 试剂配制严格按 ROS 试剂盒(南京建成生物有限公司)说明书进行，现用现配。按试剂加入操作步骤进行，同时设标准空白管、标准管，752 紫外分光光度计测定 550 nm 处光密度（D值） 。ROS=（对
10、照管 D 值-测定管 D 值）/（标准管 D 值-空白管 D 值） 标准管浓度/（蛋白毫克数/ml取样量） 。 1.2.4.2 MDA 测定 严格按试剂盒操作说明加入各试剂，用分光光度法测定 532 nm 处每管光密度。每次实验均设 2 只标准管、标准空白管和测定空白管。MDA 含量=（测定管 D 值-测定空白管 D 值）/（标准管D 值-标准空白管 D 值） 标准品浓度蛋白含量。 1.2.4.3 GSH-Px 测定 严格按试剂盒说明进行酶促反应和显示反应，测定 412 nm 处各管光密度。每次实验均设空白管、标准管。GSH-Px 活力=（非酶管 D 值-酶管 D 值）/（标准管 D 值-空白
11、管 D 值） 标准管浓度稀释倍数/反应时间/蛋白含量。 1.2.4.4 CAT 测定 取各标本 20 l 加入比色皿底部，将已预热至25，D 值在 0.50.55 之间的底物溶液 3 ml 用 5 ml 移液器快速冲入比色皿中，240 nm 处立即测定光密度，记下 D1 值，比色皿不取出，1 min后立即再测定 1 次光密度，记下 D2 值。CAT 活力=logD1/D22.303/60 s稀释倍数组织蛋白含量。 1.2.4.5 考马斯亮蓝法测定组织蛋白量 蛋白含量（mg/ml）=测定管 D 值/标准管 D 值标准管浓度。 1.2.5 脾电镜观察 实验结束后次日采用颈椎脱臼法杀死小鼠后，立即取
12、出小鼠脾脏置于培养皿中，用刀片切取约 1 mm1 mm1 mm 大小放入预冷的 2.5%戊二醛中固定，2%锇酸后固定，梯度乙醇脱水，PDAP 浸透，包埋后超薄切片，行柠檬酸铅染色后置透射电镜（HA-60，日本）下观察。 1.3 统计学处理 数据采用 xs 表示，组间显著性差异用 t 检验。2 结 果 2.1 抗肿瘤药物 DDP、ADM 对荷瘤小鼠正常组织 ROS 和 MDA 水平的影响 结果见表 1。 2.2 化疗对荷瘤小鼠正常组织 GSH-Px 和 CAT 活力的影响 结果见表 2。 2.3 白花蛇舌草对荷瘤鼠化疗后正常组织的 ROS 和 MDA 水平的影响 结果见表 3。 2.4 白花蛇舌
13、草对荷瘤鼠化疗后正常组织的 GSH-Px 和 CAT 影响 结果见表 4。表 1 DDP、ADM 对荷瘤鼠正常器官 ROS 和 MDA 的影响表 2 DDP、ADM 对荷瘤鼠正常器官 GSH-Px 和 CAT 的影响表 3 白花蛇舌草对荷瘤鼠 DDP、ADM 化疗后正常组织的 ROS 和 MDA 的影响表 4 白花蛇舌草对荷瘤鼠化疗后正常组织的 GSH-Px 和 CAT 的影响 2.5 透射电镜下各组荷瘤鼠脾脏细胞超微结构特征 对照组：可见大、中、小淋巴细胞和浆细胞，其中以小淋巴细胞较多，浆细胞和大淋巴细胞的胞质中可见大量粗面内质网，无脱颗粒现象，线粒体无肿胀，脊突明显。单纯化疗组：小淋巴细胞
14、减少，细胞核皱缩，核膜空泡，浆细胞和大、中淋巴细胞胞质中粗面内质网脱颗粒明显，线粒体肿胀，脊突破坏出现透亮区。化疗+中药组：可见浆细胞和淋巴细胞，淋巴细胞核膜未见空泡，胞质中粗面内质网脱颗粒不明显，线粒体肿胀不明显，未见透亮区。 3 讨 论 目前影响抗肿瘤药物临床应用的最重要的原因就是其严重的副作用。抗肿瘤药物造成骨髓、肝、肾等正常器官和组织损伤是否与药物产生 ROS引起不同程度的细胞毒性并导致瞬时或不可逆的损伤有关？本实验结果表明荷瘤鼠腹腔灌注 DDP、ADM 后第 10 天骨髓细胞抑制及肝、脾损伤可能与其 ROS 及其脂质过氧化产物 MDA 升高有关。ADM 是蒽环类抗生素，当机体内线粒体
15、电子传递链上的电子从 NADPH 传递到 ADM 时，ADM 中的醌环单电子还原为半醌，而半醌发生氧化反应的能障很低，可直接启动 O2 的单电子还原产生 O-2；此外，ADM 的自由基本身可直接与 H2O2 反应生产OH，这些又可激发脂质过氧化作用加重对细胞的损伤。临床应用顺铂时肾脏毒性常见，但在本实验中并未观察到 DDP 可诱导荷瘤鼠肾脏组织匀浆 ROS 和 MDA 水平升高，可能与未达到一定累积药物剂量有关，这将需进一步研究。骨髓细胞是最主要的超氧或其他氧化代谢产物来源，这也正是绝大部分抗肿瘤药物都可造成骨髓抑制的原因。 有研究证明白花蛇舌草不同溶剂提取物抗氧化活性不同，主要抗氧化成分是多
16、酚、黄酮、有机酸类，这些化合物具有改变氧化态或烯醇式与酮式官能团互变异构的化学特征，因而具有较强的抗氧化活性3 。实验结果表明化疗药物不仅可引起荷瘤小鼠正常组织细胞内 ROS 生成增加，DDP 和 ADM 还可导致包括骨髓细胞、肝脏、脾脏组织细胞抗氧化酶活性降低，细胞表达抗氧化酶如 SOD、GSH-Px、CAT 可保护细胞免受氧化损伤，这些酶活性下降进一步加重细胞氧化还原状态失调,导致机体组织细胞氧化损伤，最终可发生临床严重药物副反应。荷瘤小鼠化疗同时给予白花蛇舌草可明显降低骨髓细胞、肝脏、脾脏的 ROS 和 GSH 水平，并且可提高这些组织 GSH-Px 和 CAT 的活性，表明白花蛇舌草可
17、通过直接清除细胞内过多 ROS，并提高其他抗氧化酶活性而协同清除化疗药物产生的过量 ROS，从而避免正常器官氧化损伤，达到减少化疗药物毒副作用的目的。化疗可使荷瘤鼠脾脏产生 ROS 增加，而抗氧化酶活性显著降低，这可能是化疗损伤机体免疫细胞的重要原因。线粒体是细胞中产生 ROS 的一个重要部位，生理条件下一定的 ROS 浓度是必需的，但 ROS 生成过多会引起细胞损伤，其机理可能由于 ROS 的积累导致线粒体膨大，线粒体内膜非特异性孔道产生，细胞色素 C 从内膜脱落并流失到细胞质，膨大线粒体的形成可能是一个在亚细胞水平对不利环境的适应过程。如果这种线粒体数量增加，在细胞质中释放出的可溶性蛋白浓
18、度达到一定阈值，就会启动核凋亡。通过透射电镜观察荷瘤小鼠脾脏细胞超微结构变化，荷瘤鼠经化疗后脾脏淋巴细胞核和细胞器均出现明显变化，表现为线粒体肿胀，嵴突破坏，内质网脱颗粒，而在化疗时保护性应用白花蛇舌草的小鼠脾脏淋巴细胞上述变化明显减轻，这也表明白花蛇舌草中的某些有效成分具有调节小鼠免疫功能的作用。已有研究表明，白花蛇舌草促进荷瘤鼠脾淋巴细胞增殖也是荷瘤鼠淋巴细胞功能增强的物质基础4 。已有报道白花蛇舌草联合化疗可延长肿瘤患者生存期，减轻癌性疼痛，抑制胸、腹腔积液，提高患者生存质量5-6 。本实验中选用的白花蛇舌草水煎剂含有其各种有效成分，在对正常组织器官起到保护作用的同时是否影响其抗肿瘤作用
19、， 有待进一步的研究。 【参考文献】 1 张有会.现代肿瘤学M.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993：244 2 孟 玮，刘志强，邱世翠，等.中药白花蛇舌草对小鼠免疫功能影响的初步研究J.现代中西医结合杂志，2005，14（2）：163-164 3 于 新，杜志坚，陈悦娇，等.白花蛇舌草提取物抗氧化作用的研究J.食品与发酵工业，2002，28（3）：10-13 4 高 超，刘 颖，刘永彪 .白花蛇舌草对荷瘤鼠脾脏淋巴细胞影响的实验研究J.放射生物学杂志，2006，19（4）：310-312 5 唐立明，汪金华，周洪进.静滴白花蛇舌草注射液治疗中晚期食道癌 106 例临床观察J.海南医学，2003，14（2）：75 6 张 琼，张晓亚，庞秀华.白花蛇舌草注射液联合 EP 方案与单纯EP 方案治疗非小细胞肺癌的疗效比较J.河南职工医学院学报，2001，13（1）：44-45
