1、保妇康栓微生物限度检查法的验证【摘要】 目的：消除保妇康栓的微生物限度检查法中的抑菌作用。方法：采用薄膜过滤法进行试验，加试验菌回收并且计算回收率。结果：该供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉的回收率均高于 70 %，采用薄膜过滤法进行检验可满足要求。结论：薄膜过滤法可消除药品中抑菌物质的干扰。 【关键词】 微生物限度检查法；验证试验；薄膜过滤法；抑菌；回收率ABSTRACT Objective: To eliminate the boltUNIFEM Hong microbial limits test of the antimicrobial effect.
2、 Method: To use membrane filtration method to test, test and calculation of recycling and recovery. Results: The test for products of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Bacillus subtilis, Aspergillus niger, the recovery rates were 70 percent or more, membrane filtration metho
3、d can meet the requirement. Conclusion: The film filtration can eliminate drugs in antibacterial material interference.KEY WORDS Microbial limits test; Certification test; Membrane filtration； Antibacterial; Recovery rate药品微生物限度检查法建立时应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法是否适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定和控制菌检
4、查1 。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法和检查方法应重新验证2，3 。有些制剂有抑菌作用, 制备的供试液本身会影响微生物的生长，若不进行方法学验证，所采用的方法不一定适合该供试品的微生物限度检查4 。系统的方法学验证可以避免因为选择方法不合理而造成漏检、误判，以保证结果的科学可靠。1 材料1.1 主要仪器、药品STV3 型无菌检查薄膜滤器（浙江宁海白石药检仪器厂） ，303AS2 型数显隔水式培养箱（上海浦东荣丰科学仪器公司） ，SPX25型生化培养箱（上海跃进医疗器械厂） 。保妇康栓（批号 20060331,栓剂, 海南碧凯药业有限公司） 。1.2 培养基及稀释剂
5、玫瑰红钠琼脂培养基 、营养琼脂培养基 、胆盐乳糖培养基、改良马丁琼脂培养基、改良马丁液体培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、营养肉汤均由广东环凯微生物科技有限公司提供。1.3 验证试验用菌种金黄色葡萄球菌 CMCC(B) 26 003、枯草芽孢杆菌 CMCC(B) 63 501、大肠埃希菌 CMCC(B) 44 102、 白色念珠菌 CMCC(F) 98 001、 黑曲霉 CMCC(F)98 003、铜绿假单胞菌 CMCC（B）10 101，金黄色葡萄球菌CMCC（B）26 003、铜绿假单胞菌 CMCC（B）10 101 均由海南省药品检验所提供，以上菌种所用菌株均
6、未超过 5 代。2 方法与结果2.1 菌液制备（1）取经 3537 培养 1824 h 的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的肉汤培养物 1 mL 加 9 mL 灭菌生理盐水，采用 10倍递增稀释法，稀释至 10-510-7，控制细菌数约为 50100 cfu/ mL。 （2）取经 2328 培养 1824 h 的白色念珠菌液体培养物 1 mL加 9 mL 灭菌生理盐水，采用 10 倍递增稀释法，稀释至 10-510-7，菌数约为 50100 cfu/ mL。 （3） 取经 2328 培养 7 d 的黑曲霉菌斜面培养物，加 35 mL 灭菌生理盐水洗下霉菌孢子，采用管口带有薄无菌棉花的毛
7、细吸管吸出菌液，取 1 mL 加 9 mL 灭菌生理盐水，逐管 10倍稀释为 10-4，菌数约为 50100 cfu/ mL。2.2 供试液的制备称取本品 10 g，溶于 100 mL 无菌 pH 7.0 氯化钠 蛋白胨缓冲液中，作为 110 的供试药液。2.3 细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证2.3.1 试验方法 取 110 供试液 10 mL，过滤，用 pH 7.0 氯化钠 蛋白胨缓冲液冲洗 2 次，每张滤膜每次冲洗量为 100 mL，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于相应的培养基平板上，每种培养基至少制备一张滤膜，置规定温度中培养 2472 h。2.3.2 冲洗量的验证 取 110 供试液 1
8、0 mL，过滤，分别用100、200、300 mL 的 pH 7.0 氯化钠 蛋白胨缓冲液冲洗，最后一次冲洗液中加入 1 mL 金黄色葡萄球菌的菌悬液，过滤后取出滤膜，菌面朝上贴于相应培养基平板上，培养 2472 h，结果见表 1。表 1 冲洗量的验证2.3.3 回收率测定 （1）试验组：取 110 供试药液 10 mL，照上述方法操作,最后一次冲洗液中加入 1 mL 菌液,过滤后取出滤膜,分别菌面朝上贴于营养琼脂平皿中 3035培养 48 h 观察结果，逐日点计菌落数，以 48 h 的菌落数报告。 （2）菌液组：测定每一菌株的试验菌液1 mL,依照试验组方法进行试验。 （3）供试药品对照组：
9、不加菌液，其它操作同试验组，测定样品本底菌数。 （4）稀释剂对照组：取无菌 pH 7.0 氯化钠 蛋白胨缓冲液,按照试验组的冲洗量过滤,在最后一次冲洗中逐一加入试验菌液 1 mL, 过滤后取出滤膜, 其它操作同试验组。 （5）回收率计算公式：试验组的菌回收率(%)=（试验组菌落数均值-试品对照组菌落数均值）/菌液组菌落数均值100%，稀释剂对照组回收率(%)=稀释剂对照组菌落数均值/菌液组菌落数均值100%。海南医学院学报 Vol.15 No.1 Feb.2009 从表 2 结果可知,采用薄膜过滤法检验保妇康栓供试品，人工污染 5 株代表菌株，该供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、
10、枯草芽孢杆菌、黑曲霉的回收率均高于 70%，故可采用薄膜过滤法进行检验。表 2 薄膜过滤法各试验菌回收率（%）(冲洗量：200 mL)组别实验次数大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验组 181918279752768280867438274928981 稀释剂对照组1837989807127986777982388758390772.4 控制菌检查方法的验证 2.4.1 试验方法及菌液、供试液的制备 （1）试验方法采用薄膜过滤法5 。 （2）菌液制备：取经 37 培养 1824 h 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的营养肉汤培养物 1 mL 加 9 mL 无菌生理
11、盐水，采用 10 倍递增稀释法，稀释至 10-6，细菌数约为 10100 cfu/ mL。 （3）供试液的制备：同“2.2 项”下供试液的制备。2.4.2 验证方法 （1）试验组： 分别取几份供试液 10 mL过滤，冲洗，取出一份滤膜接入 100 mL 的胆盐乳糖培养基中；其中一份在最后一次冲洗液中加入 1 mL 菌数约为 10100 cfu/ mL 的铜绿假单胞菌，过滤后，取出滤膜接入 100 mL 胆盐乳糖培养基中作为阳性对照；另取与供试液等量的稀释剂按薄膜过滤法操作后，取出接入 100 mL胆盐乳糖培养基中作为阴性对照，3537 培养 1824 h，取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三
12、甲铵琼脂培养基平板上，培养 1824 h，结果见表 3。 分别取几份供试液 10 mL 过滤，冲洗，取出一份滤膜接入 100 mL 的营养肉汤培养基中；其中一份在最后一次冲洗液中加入 1 mL 菌数约为 10100 cfu/ mL 的金黄色葡萄球菌，过滤后，取出滤膜接入 100 mL 营养肉汤培养基中作为阳性对照；另取与供试液等量的稀释剂按薄膜过滤法操作后，取出接入 100 mL 营养肉汤培养基中作为阴性对照，3537 培养 1824 h，取上述培养物，划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，培养 1824 h，结果见表 3。 （2）阴性对照组： 取 100 mL 的胆盐乳糖培养基和营养肉汤培
13、养基，照试验组同法操作，分别加入大肠埃希菌 10100 cfu/ mL 作为阴性对照，3537 培养 18 24 h，取此培养物分别划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板和甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，置 3537 培养1824 h，结果见表 3。从表 3 结果可知，试验组铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌生长良好，本品对其没有抑菌作用；阴性菌未检出，表明该检查方法的专属性良好，可用于保妇康栓的控制菌检查。表 3 控制菌检查结果（冲洗量200 mL） 注:“”代表反应阳性， “”代表反应阴性。3 结论药品要做微生物限度检查前,应该确认所选用的方法,需根据药品的性质选用适宜的一种方法或几种方法进行
14、验证,确认所选用的方法是否可行,所得结果是否真实、可靠。本试验结果可知，保妇康栓的微生物限度检查可采用薄膜过滤法5进行,即取本品 10 g 溶于 100 mL 的无菌 pH 7.0 氯化钠 蛋白胨缓冲液中，取 1 mL 薄膜过滤,以 0.1 %蛋白胨水冲洗, 冲洗量为 200 mL。保妇康栓本身具有抑菌作用, 制备的供试药液会影响微生物的生长，经微生物限度检查法的验证试验证明，选用薄膜过滤法可消除药品中抑菌物质的干扰，得到准确的测定结果。【参考文献】1 张道坤，张路兵，曾元临，等.经辐照氯银处理脐静脉的抑菌效果观察J.实用临床医药杂志，2006，10（4）：12 ，6.2 马绪荣,苏德模. 药品微生物学检验手册M.北京:科学出版社,2001.40.3 刘泽春.基层卫生微生物检查质量控制J.中国卫生检验杂志，2000，10（5）:622.4 裘雪友.药师手册M.第 2 版.北京：人民军医出版社，2003.41.5 国家药典委员会. 中华人民共和国药典S.2005. 一部.北京:化学工业出版社,2005. 附录.93.
