1、百草枯人工抗原的合成及抗体的制备作者：杨婷婷, 孙秀兰, 邵景东, 王洪新【摘要】 目的: 制备百草枯人工抗原和抗血清, 为建立酶联免疫吸附法提供技术储备。方法: 以 4, 4 联吡啶和碘甲烷为起始原料 , 于暗处通氮气保护下合成了百草枯半抗原; 混合酸酐法偶联大分子蛋白载体牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白（OVA）制备免疫抗原和包被抗原; 免疫新西兰大白兔, 制备多抗。结果: 合成的半抗原经 HPLCMS 、 1HNMR和 IR 鉴定, 初步确定合成成功; 百草枯半抗原与 BSA 和 OVA 的结合比分别为 191 和 141; 抗血清经间接 ELISA 法检测, 效价达12.56104,
2、经饱和硫酸铵沉淀法纯化后抗体的效价达15.12104。结论: 合成的百草枯人工抗原具有较好的免疫原性, 为百草枯酶联免疫检测（ELISA）试剂盒的研制提供了基础。 【关键词】 百草枯; 抗原; 抗体; 免疫检测百草枯（paraquat, PQ）又名克无踪、 对草快, 化学名为 1, 1二甲基4, 4 联吡啶阳离子盐, 是一种广谱、 灭生性有机杂环类除草剂1 。百草枯可经胃肠道、 皮肤和呼吸道吸收, 易导致肺纤维化2 。为了保护人类健康和环境安全, 许多国家严格限制使用百草枯3 。我国 2005 年发布并实施的国家标准食品中最大农药残留限量中规定蔬菜、 柑橘、 小麦粉中百草枯的最大残留限量分别为
3、 0.05、 0.2、 0.5 ppm。高效液相色谱分析法、 气相色谱分析法等仪器分析法样本前处理及测定过程繁琐, 费用高, 不适于大量样本筛查。而酶联免疫吸附检测法（Enzymelinked Immunosorbent assay, ELISA）灵敏度高, 特异性强, 仪器设备要求低和样本前处理相对简单等优点, 适于现场监控和大量样本筛查。特异性抗体的制备是建立免疫分析法的必要前提。百草枯的相对分子质量(Mr)仅为 257 000, 属于半抗原, 而且自身没有可供偶联的活性官能团（如氨基、 羧基等） 。本研究在前期工作中, 选择百草枯结构类似物 4, 4 联吡啶, 设计和合成了具有活性羧基的
4、百草枯半抗原。我们采用混合酸酐法合成人工抗原, 并进行结构鉴定, 经免疫新西兰大白兔后, 获得了较高效价的特异性多克隆抗体。1 材料和方法1.1 材料 二噁烷、 无水三正丁胺、 牛血清白蛋白（BSA） 、 卵清蛋白（OVA）均购自 Sigma 公司; 氯甲酸异丁酯购自 Fluka 公司; 弗氏完全、 不完全佐剂购自北京生物制品研究所; 四甲基联苯胺（TMB） 、 羊抗兔 IgG 购自北京博奥森有限公司; 其他试剂均为分析纯。紫外可见光分光光度计 Spectronic 1.70 为意大利 GBC 公司产品; Nexus 670 型傅立叶变换红外光谱仪为 Nicolet 公司产品; 酶标仪 MK3
5、 购自上海智理科学仪器有限公司。1.2 方法1.2.1 混合酸酐法合成百草枯人工抗原 （1）取前期合成的百草枯半抗原（PQh ）16 mg 溶于 600 L 二噁烷中 , 搅拌使其溶解。然后加入无水三正丁胺 70 L, 将此混合物在 4冰浴中冷却, 并搅拌 15 min。加入重蒸的氯甲酸异丁酯 30 L, 4 左右搅拌 30 min。 （2）52 mg BSA 溶于 4.5 mL 水中, 用 0.1 mol/L 的 NaOH 调 pH 至 9.0。将上述PQh 溶液逐滴加入到溶解的蛋白中, 并于 4轻微搅拌 4 h, 整个过程维持 pH 在 9.0。然后, 将混合物于 4对 0.1 mol/L
6、 pH7.4 的 PBS 中透析 72 h, 每隔 6 h 换透析液 1 次。冷冻干燥后于-20保存。用同样的方法合成包被抗原 PQhOVA 5 。1.2.2 百草枯人工抗原结构的鉴定 所得的百草枯人工抗原采用Nexus 670 型傅立叶变换红外光谱仪(IR)鉴定结构。1.2.3 人工抗原偶联比的测定 （1）摩尔消光系数 的测定。配制 PQ 浓度为 0、 0.01、 0.02、 0.03 g/L 的水溶液, 通过紫外扫描可知 PQ 的最大吸收波长为 260 nm, 在 260 nm 处测吸光值, 每个浓度做平行样。摩尔消光系数 吸光值/摩尔浓度。 （2）人工抗原中蛋白质含量的测定。采用 Bra
7、dford 法测定人工抗原中蛋白质含量, 以超纯水配制BSA 浓度分别为 0.01、 0.02、 0.04、 0.06、 0.08、 0.1 g/L, 配制人工抗原浓度为 1 g/L, 在波长为 595 nm 下测定其吸光值, 绘制 CA 曲线, 并计算人工抗原中蛋白质含量6 。 （3）偶联比的测定。配制 0.1 g/L BSA 的水溶液, 将偶联产物用超纯水稀释到 0.1 g/L, 在 260 nm 处测吸光值, 以超纯水为空白 , 吸光值为 A1、 A2。偶联比率 r 为: r=（A2A1）/（0.1/65 000）, 其中 为摩尔消光系数（L/mol）, 65 000 为 BSA 分子量
8、, 0.1 为 BSA 浓度（g/L） 。1.2.4 抗体的制备 将合成的百草枯人工抗原（PQhBSA ）免疫 2 只健康雄性新西兰大白兔（质量在 2.0 kg 左右） 。免疫前 1 周从耳缘静脉采血作阴性对照。称取 1 mg PQhBSA, 用 5 mL 0.1 mol/L 的PBS（经高压灭菌）溶解, 然后取 0.5 mL 溶解的抗原与 0.5 mL 完全福氏佐剂充分混合, 乳化后在新西兰大白兔背部进行多点皮下注射。1 个月后进行第 1 次加强免疫, 采用四肢内部肌肉注射, 剂量与首次免疫相同, 与等量不完全福氏佐剂混合充分乳化。共免疫 5 次, 每次间隔 2 周。每次加强免疫前从兔耳静脉
9、采血, 采用间接 ELISA 法测定抗血清的效价。效价合格后, 兔颈动脉放血, 分离抗血清, 并采用饱和硫酸铵沉淀法7纯化抗体, 制成冻干粉, 于-20保存。1.2.5 抗体效价的测定 采用间接 ELISA 法测定抗体的效价。（1）包被: 将酶标板每孔加入 100 L PQhOVA （用 0.05 mol/L pH9.6 的 Na2CO3NaHCO3 缓冲液从 1 g/L 的储备液倍比稀释） , 4, 静置过夜。取出, 用 0.1 mol/L、 pH7.4 的 PBSTween 缓冲液（含 0.5 mL/L Tween20 ）满孔洗涤 3 次, 扣干。 （2）封闭: 每孔加 250 L 10
10、g/L BSAPBS 溶液(溶于 0.01 mol/L PBS, pH7.4), 进行封闭, 37保温 2 h, 弃去封闭液, PBST 洗涤 3 次, 每次 1 min, 扣干。 （3）加抗血清: 将抗血清用 1 g/L BSAPBS 溶液倍比稀释。每孔加 100 L 不同稀释度抗血清（纯化前和纯化后）和阴性血清（免疫前兔血清）, 做 3 个平行, 37孵育 1 h。PBS Tween 洗涤, 扣干 3 次。 （4）加酶标二抗: 每孔加100 L 羊抗兔 IgGHRP 结合物（用 1 g/L BSAPBS 溶液按体积比15 000 稀释）, 37孵育 0.5 h, 然后用 PBST 缓冲液洗
11、涤扣干 4 次。（5）显色反应: 每孔加入配制好的四甲基联苯二胺（TMB）底物液 100 L, 37孵育 15 min, 取出, 立即加入 50 L 2 mol/L 硫酸终止反应。用酶标仪测 A450 值。 （6）效价确定: 以阴性血清的吸光值为标准, 吸光值大于或等于该值的 2.1 倍所对应的抗血清的稀释度即为该血清效价。2 结果2.1 百草枯半抗原的合成结果 由于百草枯衍生物暴露在空气中易氧化, 实验在 Van Emond 等4的合成方法的基础上加以改进, 使反应在通氮气保护并避光条件下进行, 以 4, 4 联吡啶和碘甲烷为起始原料, 严格控制反应物的量, 经三步反应合成了百草枯半抗原 N
12、 甲基N 戊酸基 二吡啶二溴化物（简称 PQh ）, 从而减缓了产物的氧化。用 HPLCMS 、 1HNMR、 IR 对三步的反应产物结构进行了鉴定, 经分析证明合成的百草枯中间体纯度较高, 三步反应的产物纯度分别为 950 mL/L、 700 mL/L 和 960 mL/L, 得率分别为 860 mL/L、 750 mL/L、 690 mL/L, 可不经纯化直接用于与蛋白偶联。2.2 百草枯人工免疫原的紫外吸收图谱 由于百草枯半抗原的紫外吸收在 260 nm 左右, 而 BSA 在 260 nm 和 280 nm 均有吸收, 将 BSA 及PQhBSA 用凝胶色谱 紫外检测器检测, 由图 1
13、 中的 A 和 B 可以看出, BSA 在 260 nm 的吸收比 280 nm 的弱, 当百草枯半抗原接 BSA 后, 由 C和 D 可以看出, PQhBSA 在 260 nm 的吸收增强, 可初步确定蛋白与百草枯半抗原偶联成功。2.3 人工免疫原 PQhBSA 的 IR 鉴定 通过比较 BSA 和PQhBSA 的红外吸收光谱, 发现在 2 800 cm-13 400 cm-1 区域以及1 500 cm-11 700 cm-1 区域具有相似的吸收, 此为蛋白质中氨基酸的特征吸收, 说明合成的 PQhBSA 化合物具有 BSA 的特征官能团。将PQhBSA 与 PQh 的红外光谱进行比较, 在
14、 800 cm-11 200 cm-1 之间, 出现了明显的百草枯半抗原特征峰, 而 BSA 在此处无明显吸收, 说明 PQhBSA 具有 PQh 的特征官能团（图 2）, 由此说明 PQhBSA人工免疫原偶联成功, 可以用来免疫实验动物。2.4 百草枯人工抗原偶联比的计算 由 PQ、 BSA 和 PQhBSA的紫外扫描结果, 图 3 可以看出, PQh 在 260 nm 处具有特征吸收, BSA在 278 nm 具有特征吸收, PQhBSA 与两者相比发生了明显变化, 表明半抗原与载体蛋白成功地发生了偶联。以吸光度（Y）对相应的浓度（X）作标准曲线, 回归方程为 Y=6.7375X+0.02
15、7, R2=0.9949。参照标准曲线制作步骤, 取待测的人工抗原稀释 15 倍, 最后测得 A595 值为 0.122, 对照标准曲线方程知, 蛋白浓度为 0.014 g/L。由此可知, 样品的实际浓度为 0.211 g/L。PQhBSA 在 260 nm 处其吸光值为 0.358, 同浓度的BSA 的吸光值为 0.132。计算得 PQ 最终的平均摩尔吸光系数为 7731.2 L/mol。根据计算公式, 则免疫抗原中 PQh 与 BSA 的偶联比为: r=（0.358-0.132）/7731.2/（0.1/65000）=191, 同理计算包被抗原中 PQh 与 OVA 结合比为 141。图
16、3 PQ、 BSA 和 PQhBSA 的紫外扫描图谱 2.5 抗体的效价 根据方阵滴定原理, 采用间接 ELISA 法测定纯化前后抗百草枯抗体的效价, 结果显示, 当包被原浓度为 1.0 mg/L 时, 抗血清效价达 2.56104, 抗体纯化后冻干粉的效价则达 5.12104。这说明 PQhBSA 免疫原的合成是成功的, 而且纯化后抗体的效价有所提高。3 讨论在农药残留的免疫学分析中, 人工抗原的合成是制备抗体和建立免疫分析方法最关键的步骤。半抗原偶联到载体上的数目常会影响到抗体的滴度, 但到目前为止, 最佳的偶联数目尚无定论, 一般认为在 825之间较合适8 。本研究将合成的百草枯半抗原采
17、用混合酸酐法偶联到载体蛋白（BSA、 OVA）上, 偶联比分别为 191 和 141。然后免疫兔子获得了高效价的抗百草枯多克隆抗体。当包被原浓度为 1.0 mg/L 时, 抗血清效价达 2.56104, 抗体纯化后冻干粉的效价则达 5.12104, 这说明纯化对于抗体效价的提高起到了作用。这为下一步百草枯 ELISA 试剂盒的研制提供了依据。【参考文献】1 曾 铭. 共振光散射光谱法机理研究及其在农药分析中的应用D. 四川: 四川师范大学, 2006.2 夏 敏, 刘建华. 百草枯中毒研究现状 J. 四川医学, 1995, 16（4）: 237-239.3 吴厚斌, 宋俊华, 马 进, 等.
18、百草枯在欧盟批准继续使用 J. 农药科学与管理, 2004, 25（1）: 36-37.4 Van Emon J, Hammok B, Seiber JN. Enzymelinked immunosorbent assay for paraquat and its application to exposure analysisJ. Anal Chem, 1986, 58（8）: 1866-1873.5 Spinks CA, Wang B, Mills EN, et al. Development of an ELISA for paraquat: improvement of antibody characteristics by reversed affinity chromatographyJ. Analyst, 1999, 124(6): 847-850.6 陈新建, 陈梅英, 赵会杰. 免疫学技术在植物科学中的应用M. 北京: 中国农业大学出版社, 1998: 54-58.7 王廷华, 李官成, Zhou XinFu. 抗体理论与技术M. 北京: 科学出版社, 2005: 315.8 贺铁明, 胥传来, 王武康. 盐酸克伦特罗免疫原的合成与鉴定J. 中国粮油学报, 2004, 19（2）: 85-88.
