1、薄层色谱-荧光分光光度法测定黄连及香连丸中盐酸小檗碱的含量作者：文欣欣,刘丹华,余陈欢,吴巧凤【摘要】 目的 建立黄连和香连丸中盐酸小檗碱的含量测定方法。方法 样品经提取、薄层展开后,采用薄层色谱-荧光分光光度法对黄连和香连丸中盐酸小檗碱进行含量测定,展开剂为苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-氨水(631.51.50.5),激发波长 Ex365 nm,发射波长 Em409 nm。结果 盐酸小檗碱在 0.4733.784 g 范围内线性关系良好,r0.999 3。黄连的回收率为 99.03%,RSD1.86%。香连丸的回收率为97.10%,RSD1.09%。结论 该法操作简便,分离效果好,灵敏度高。
2、【关键词】 黄连；香连丸；荧光分光光度法；盐酸小檗碱；含量测定Key words： Coptis chinensis Franch.；Xianglian Pills；fluorescence spectrophotometry；berberine hydrochloride；content determination黄连为毛茛科植物黄连(Coptis chinensis Franch.)、三角叶黄连(Coptis deltoides C.Y.Cheng et Hsiao)或云连(Coptis teeta Wall.)的干燥根茎,具有清热燥湿、抗菌消炎、利胆等功效,临床上用于治疗消化道感染、泻痢
3、等疾病。以黄连作原料的中成药香连丸气微、味苦,具有清热燥湿、行气止痛等功效,临床多用于湿热痢疾、里急后重、腹痛泄泻、菌痢、肠炎等症。盐酸小檗碱为两者共有的有效成分,具有抗菌、抗病毒、抗凝等作用,治疗原发性高血压、糖尿病等疾病。本试验采用薄层色谱-荧光分光光度法测定黄连和香连丸中盐酸小檗碱的含量,为其质量控制提供依据。1 仪器与试药RF-5000 荧光分光光度计(日本岛津),UV-1 型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂),AG135(四川时运成套仪器有限公司),80-2 离心沉淀器(上海手术器械厂),CQ-250 超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所
4、,批号 0713-9906)；黄连(贵州,批号 20060424；四川,批号 20060827、20070422)。药材经本校资源鉴定教研室姚振生教授鉴定为黄连 Coptis chinensis Franch.；香连丸(湖北诺得胜制药有限公司,批号 061001、070101；湖北瑞华制药有限责任公司,批号 060117)。硅胶 G(青岛海洋化工有限公司,批号 050428)；其他试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 对照品溶液和供试品溶液的制备精密称定干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品 4.73 mg,置于 10 mL 容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得浓度为 0.473 mg/mL 的对
5、照品溶液。取黄连药材粗粉约 0.1 g,精密称定,置 100 mL 容量瓶中,加盐酸-甲醇(1100)溶液约 95 mL,60 水浴加热 15 min,取出,超声处理 30 min,室温放置过夜,加甲醇至刻度,滤过,滤液作为黄连供试品溶液1。精密称取香连丸约 0.4 g,加适量盐酸-甲醇(1100)溶液,索式回流提取至无色,提取液置水浴上蒸至约 20 mL,定量转移至 50 mL 容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为香连丸供试品溶液2。2.2 薄层分析条件3用 0.3%CMC-Na 为粘合剂自制硅胶 G 板,取对照品溶液适量,点样后用氨水饱和 30 min,以苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-氨水
6、(631.51.50.5)为展开剂,展距 10 cm,晾干后置紫外光(365 nm)下检视,盐酸小檗碱呈黄绿色荧光斑点(Rf0.40)。2.3 荧光条件的确定取对照品溶液,用荧光分光光度计扫描,结果显示,盐酸小檗碱最大激发波长 Ex365 nm,最大发射波长 Em409 nm。取对照品溶液 1 mL,分别加入不同体积的 1 mol/L NaOH 溶液,并用甲醇定容至 2 mL,在 Ex365 nm、Em409 nm 处测定其荧光强度。结果表明,随着 NaOH 量的增加,其荧光强度不断增大,当加入 50 L 时荧光强度最大,此后继续增加 NaOH 用量时其荧光强度变化不大。故试验中确定NaOH
7、加入量为 50 L。2.4 线性关系考察分别吸取对照品溶液 1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、8.0 L,间隔1.5 cm 依次点于同一硅胶 G 板上,按“2.2”项下条件展开,将相应斑点刮入离心管中,同行空白。各斑点用甲醇洗脱并将洗脱液依次转移至 2 mL容量瓶中,加入 1 mol/L NaOH 溶液 50 L,甲醇定容,摇匀,在 Ex365 nm、Em409 nm 处测定荧光强度,以荧光强度为纵坐标,盐酸小檗碱含量为横坐标,得回归方程为：Y10.337X1.897,r0.999 3,表明盐酸小檗碱在 0.4733.784 g 范围内荧光强度与其含量线性关系良好。2.5 精密度试验2.
8、5.1 同板精密度 精密吸取对照品溶液 10 L,点于同一硅胶 G 板上,呈等距离的 6个点,按“2.4”项下方法测定,结果 RSD1.34%。2.5.2 异板精密度 精密吸取对照品溶液 10 L,点于 6 个不同的硅胶 G 板上,按“2.4”项下方法测定,结果 RSD2.55%。2.6 稳定性试验取同一份对照品洗脱液,每隔 20 min 测定一次荧光强度,连续测定7 次,结果 RSD1.50%,表明盐酸小檗碱在该条件下 2 h 内稳定性良好。2.7 重复性试验取黄连(批号 20060827)和香连丸(批号 061001)各 5 份,按“2.1”项下方法提取,并按“2.4”项下方法测定,结果黄
9、连中盐酸小檗碱平均含量为 8.04%,RSD1.49%；香连丸中盐酸小檗碱平均含量为3.47%,RSD2.39%。表明本法重复性良好。2.8 样品含量测定精密吸取对照品溶液及黄连、香连丸提取液各 10、20、10 L,分别点于同一硅胶板上,按“2.2”项下条件展开,将相应斑点刮入离心管中,加入甲醇 1.5 mL,振摇 5 min,超声 15 min, 3 000 r/min 离心 10 min,取上清液,置 2 mL 容量瓶中,加入 1 mol/L NaOH 溶液 50 L,甲醇定容,摇匀,测定其荧光强度,平行测定 3 次。结果见表 1。表 1 黄连和香连丸中盐酸小檗碱含量测定结果(略)2.9
10、 加样回收率试验精密称取已知含量的黄连约 0.1 g(批号 20060827)及香连丸约 0.4 g(批号 061001),各 6 份,分别加入适量的盐酸小檗碱对照品溶液,按“2.1”及“2.4”项下方法操作,测定其含量,计算回收率,结果见表 2。表 2 黄连和香连丸中盐酸小檗碱加样回收率试验结果(略)3 讨论本试验曾分别采用乙醇和盐酸-甲醇(1100)溶液对样品进行提取,结果发现,采用乙醇提取时,小檗碱提取率不佳,在本试验薄层展开条件下,难以达到理想的分离效果；而采用盐酸-甲醇(1100)溶液提取时,黄连及香连丸中小檗碱与盐酸反应形成生物碱盐,使其溶解度增加,提取较为完全,且在本试验薄层展开
11、条件下能较好的分离,故选用盐酸-甲醇(1100)溶液作为提取溶剂。目前,盐酸小檗碱的含量测定方法有薄层色谱法、紫外分光光度法、高效液相色谱法等4-5,由于本试验样品成分复杂,干扰较大,采用薄层色谱法、紫外分光光度法进行含量测定往往背景干扰大,重现性差；而高效液相色谱法易造成色谱柱的钝化。荧光分光光度法具有灵敏性高、选择性强、试验样品量少、设备简单的特点,适用于痕量成分的检测。本试验采取薄层色谱-荧光分光光度法,可以减少盐酸小檗碱衍生物等成分的干扰,简便、有效、回收率高,适用于黄连和香连丸的质量控制。【参考文献】1 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)S.北京：化学工业出版社,2005.213.2 周华平,宋广聪,王仁英.薄层扫描法测定香连丸中盐酸小檗碱的含量J.基层中药杂志,2000,14(5)：1516.3 杨广德,杨二库,王嗣岑.薄层色谱-荧光分光光度法测定黄连中小檗碱的含量J.西北药学杂志,2000,15(4)：159.4 梁生旺.中药制剂分析M.北京：中国中医药出版社,2004.115118.5 桑 媛,张冬海.黄柏胶囊中小檗碱含量的分光光度分析J.中国药业, 2006,15(5)：50.
