1、人 A549 肺腺癌始动细胞的富集和 鉴定 林盛， 张振华， 饶明月，吴敬波 （泸州医学院附属医院肿瘤科， 646000）摘要:目的 利用紫杉醇联合无血清培养完成对 A549 肺腺癌始动细胞的富集并鉴定富集亚群的干细胞特性。方法 对数生长期的 A549 细胞经胰酶消化，干细胞培养基重悬，得到成球状生长的细胞；传至第二代时加入紫杉醇作用 48h，离心去除死细胞和紫杉醇，换新鲜干细胞培养基培养，至存活细胞恢复克隆生长后鉴定其干细胞相关特性。结果 用紫杉醇联合无血清培养方式法成功从 A549 细胞中富集得到 肿瘤干细胞， 该群的细胞高表达 CD133/CD326 分子 及干细胞相关基因，具有多向分化
2、潜能，高表达干细胞相关基因及和更强的致瘤能力，具 备干细胞相关特性。 结论 紫杉醇联合无血清培养富集得到高表达 CD133/CD326 分子的 细胞亚群， 该亚群具备干细胞相关特性，可用于后续肺腺癌干细胞生物学特性的研究。关键词:肿瘤始动细胞；A549;紫杉醇Enrichment and identification of lung adenocarcinoma initiating cells from A549LIN Sheng, ZHANG Zhen-hua, RAO Ming-yue, WU Jing-bo(Oncology Department, Affiliated Hospita
3、l of Luzhou Medical College, Sichuan 646000, China)Abstract: Objective To obtain the lung adenocarcinoma initiating cells from the A549 cell line based on paclitaxel treatment combination with serum-free cultivation and to validate spared cells can represent tumor initiating cells (TICs). Methods Af
4、ter dissociated by trypsogen, about 106/ml cells were suspended in serum-free medium supplemented with 0.4% BSA, insulin, basic fibroblast growth factor (bFGF), human recombinant epidermal growth factor (EGF) and obtained spheroid cells. At the second passage, paclitaxel was added at a concentration
5、 of 100nmol/L for 48 h and then replaced with completely fresh medium once or twice per week until new spheroids emerged. Results The subpopulation of cells that survived serum-free cultivation and paclitaxel treatment could highly express the CD133/CD326 molecular markers and have features of stemn
6、ess including differentiation, high expression of CSCs-associated genes and stronger capability of tumorigenesis.Conclusions The survived subpopulation that highly express the CD133/CD326 molecular markers presenting the characteristics of stemness in vitro and in vivo, and could be used in future 基
7、金项目：国家自然科学基金资助项目（81201682）。 通 讯作者，Email:researches of biological functions.Key words: tumor initiating cells; A549; paclitaxel非小细胞肺癌（NSCLC）是重要的 恶性肿瘤致死原因。近十年以来，随着诊断水平的提高和综合治疗模式（新辅助化疗，高精度放疗以及分子靶向治疗）的改进，使肺癌病员有所受益，但总 5 年生存率改善并不明显。大量的研究证实， 在肿瘤组织中存在为数极少数的细胞（肿瘤始动细胞或癌干细胞）：，其具备始动肿瘤发生、维持自我更新、 治疗放化疗抗拒、 等特点，有更强
8、的侵袭和致瘤能力，是 肿 瘤复发和转移的根源。从肿瘤干细胞层面进行研究将有利于阐明肺癌的发生、发展机制，发现新的临床诊疗靶点以达到提高疗效之目的。本研究中，我们采用紫杉醇联合无血清逆向诱导的方法从 A549 细胞株中富集肺腺癌始动细胞，进行相关干细胞特性的验证，为后期肿瘤干细胞生物学特性的研究奠定基础。1 资料与方法1.1 细胞来源 A549 人肺腺癌细胞株，购自美国 ATCC 中心；1.2 动物来源 雄性健康裸鼠 6 只， 4 周龄，泸州医学院附属医院中心实验室代购自中国医学科学院，无特定病原体级；1.3 主要试剂和仪器 重组人 bFGF、重组人 EGF 购自 Pepro Tech 公司，重
9、组人胰岛素、牛血清白带白（BSA）购自 Sigma 公司，鼠抗人 CD133/1-PE 流式抗体、鼠抗人 CD326-FITC 流式抗体，鼠源同型 IgG1-PE、鼠源同型 IgG1-FITC,购自 Miltenyi Biotec 公司。紫杉醇注射液购自山西普德药业有限公司, 兔抗人 CD133(Abcam 公司),山羊抗人CD326(Santa Cruz 公司 ), FITC-山羊抗兔 IgG(Beyotime 公司),CY3-驴抗山羊IgG(Biolegend 公司) , DAPI 工作液( Beyotime 公司),山羊抗兔 IgG 及兔抗 CK8/18 工作液(中衫金桥生物技术有限公司
10、),DAB 显色试剂盒及免疫组化试剂盒(SABC 法)购自DAKO 公司,抗荧光淬灭封片液(Beyotime 公司)。倒置相差显微镜、流式 细胞仪及激光共聚焦均由泸州医学院中心实验室提供。1.4 A549 细胞的逆向 诱导 取对数生长期 A549 细胞，胰酶消化后离心，用干细胞培养基重悬，第二天即可见成球状生长细胞的出现；成球细胞达到传代量（细胞密集，成球多、成球大、致密，机械吹散成小细胞团后第二天即恢复到之前的状态）后，加入等量的干 细胞培养基，吸管反复轻柔吹散成球细胞后，吸取半量细胞悬液至新培养瓶，完成 传代。1.5 紫杉醇对诱导细胞的富集 成球细胞传至第二代，细胞达到传代量后将细胞尽量机
11、械吹散至单个细胞； 106 个/ml 级的 A549 细胞对应紫杉醇浓度 0.1mol/L，作用 48 h 后离心换用新鲜干细胞培养基；换用培养基后第二天可见大量成球细胞死亡，仅少数由两到三个聚成的细胞克隆存在；据成球细胞的多少及大小使用低速离心 600-800 rpm，将存活的细胞克隆选出，去除死细胞碎片， 换新鲜培养基继续培养，隔天 观察细胞状态，每周对细胞进行换液（1-2 次），直细胞恢复加药前的生长状态。1.6 CD133/CD326 流式细胞检测 待检细胞（A549 细胞消化离心，悬浮细胞收集离心）用 PBS 洗涤 2 次；设置同型和待 检组，按照使用 说 明分别加入相应的 CD13
12、3/CD326 流式抗体及同型（浓度为 1：11）孵育 30 分钟；PBS 洗涤三次后样本避光送检。1.7 成球细胞 CD133/CD326 的免疫荧光检测 紫杉醇处理后第四代成球细胞，吸取细胞悬液至载玻片，涂片离心机，800 rpm，离心 5 分钟后浸入 4%多聚甲醛固定 20 分钟； 0.1%的 Triton 作用 3 分钟 后 PBS 洗涤；滴加 5%的 BSA 作用 10 分钟后用吸水纸吸净。滴加 1：300 的兔抗人 CD133 和山羊抗人 CD326 一抗，4 冰箱避光孵育过夜。次日，将玻片常温放置 30 分钟，PBS 洗涤三次，滴加 1：400 的羊抗兔-FITC-CD133，驴
13、抗山羊-CY3-CD326 荧光二抗，避光孵育 30 分钟后 PBS 洗 涤三次；滴加 DAPI 工作液，复染细胞核 4 分钟，PBS 洗涤三次，抗 荧光淬灭封片剂后送 检。1.8 成球细胞分化 实验 将生长状态良好的成球细胞吸入六孔板中，平板离心机，1500 rpm,离心 5 分钟，弃掉干细 胞培养基；重新加入含 10%标准胎牛血清的完全培养基，每孔 4 ml，常态培养，每天 观察细胞形态变化情况，第六天取出盖玻片，4%多聚甲醛固定30 分钟；PBS 洗涤后将其置入 0.3%的双氧水处理 20 分钟；PBS 漂洗，血清封闭处理 30分钟，滴加 CK8/CK18 单克隆抗体，孵育过夜；PBS
14、漂洗后滴加第二抗体（山羊抗兔）后37 孵育 30 分钟；PBS 漂洗，加入 SABC 后 37 孵育 30 分钟；PBS 漂洗，DAB 显色，苏木素细胞核复染，经分化，蓝化后，梯度乙醇脱水处理，透明后中性树胶封片送检。1.9 裸鼠成瘤实验 生长良好 4 周龄、雄性裸鼠 9 只，三只 /组，分为三个实验组；选取生长状态良好，能进行传代的 A549 细胞及成球细胞，收集到离心管，1500 rpm,5 分钟；去掉上清，按不同细胞加入相应的培养基各 1 ml，充分吹散细胞，计数后调整细胞浓度；CD133+/CD326+细胞的浓度分别为 1104，1105 和 5103 个/ml 对应普通 A549 细
15、胞1104，1105 和 1106 个/ml ；CD133+/CD326+细胞注射在裸鼠的左前腋下， A549 细胞注射在裸鼠的右前腋下；观察成瘤情况，在瘤体最大径线达到 2 cm 后处死所有老鼠，剥离肿瘤进行病理学检查。2.结 果2.1 逆向诱导联合紫杉醇的富集结果 普通 A549 细胞胰酶消化后用干细胞培养基诱导成球状生长，传代培养至第二代，加入紫杉醇 处理 48h 后换以新鲜干细胞培养基，可 见大部分成球细胞裂解，仅有极少数的细胞克隆存活；视细胞的生长状态进行离心换液，大约经过两周时间，残存的细胞能重新恢复克隆生长，见图 1。a：A549 细胞诱导第 2 代；b：紫杉醇处理后第 4 天，
16、细胞大部分死亡；c：紫杉醇处理后第 14 天（200）图 1 紫杉醇联 合干细胞培养基逆向诱导对 A549 始动细胞的富集2.2 富集细胞的 CD133/CD326 流式检测结果 紫杉醇处理后的细胞恢复正常克隆生长状态后，能在体外连续的传代培养；细胞球数目明显增多，体积变大，胞 浆折光度佳。第四代细胞 CD133/CD326 双阳性率在 80%-90%，证实 紫杉醇联合干细胞培养基逆向诱导可有效富集 CD133/CD326 细胞亚群， 见图 2。a：富集细胞第 4 代（200）；b：第四代富集细胞的 CD133/CD326 双阳性率图 2 富集细胞第四代的生长状态及 CD133/CD326 的
17、流式测定2.3 富集细胞的免疫荧光检测结果 紫杉醇处理后第四代成球细胞进行 CD133/CD326分子表达的荧光检测，在共聚焦显微镜下可以看到成球细胞中绝大多数的细胞均表达CD133(绿色荧光)和 CD326（红色荧光），荧光主要分布在细胞膜上，部分位于胞质， 见图 3。a：DAPI 染色 显示细胞核呈 现蓝色；b：CD133 的表达（绿色荧光）；c：CD326 的表达（红色荧光）；d：CD133/CD326 的共表达（显示为橙色荧光）图 3 第四代成球细胞的免疫荧光共聚焦检测2.4 成球细胞的分化和分化抗原 CK8/CK18 的表达 成球细胞在分化培养基条件下，一天即可贴壁生长，细胞形态由圆
18、形逐渐变扁圆形，在第六天就和普通 A549 细胞的形态基本相似；对第六天的细胞进行免疫组化检测发现细胞均表达分化抗原 CK8 或者 CK18,证实 CD133+/CD326+细胞亚群具备分化的功能， 见图 4。a：成球细胞在完全培养基中 24 h 的生长状态（细胞贴壁族团状生长）；b：成球细胞分化第六天，细胞与普通 A549 细胞外形相似；c：免疫组化测定分化地六天细胞 CK8/CK18 分化抗原的表达显示全部细胞均表达 CK8/CK18 分化抗原（ 200）图 4 成球细胞的分化及分化抗原的免疫组化检测2.5 裸鼠成瘤实验 CD133+/CD326+细胞注射在裸鼠的左前肢腋下，A549 细胞
19、注射在小鼠的右前肢腋下；结果显示 1104级的 CD133+/CD326+细胞即能成瘤而 105级的 A549细胞也不能成瘤，证实富集细胞具备更强的致瘤能力，见图 5。a：两种细胞悬液浓度均为 1104 个/ml 时，仅 CD133+/ CD326+细胞成瘤（左前腋下）；b：剥离的移植瘤；c：移植瘤送检 HE 染色示腺癌组织（200）图 5 裸鼠成瘤及病理检测3讨 论癌干细胞存在于大多数实体肿瘤中，并能为某些表面分子所标记:乳腺癌以CD44+/CD24-/low作为干细胞分子标记 【1】，黑色素瘤以CD133 +或者CD20 +作为干细胞分子标记 【2】，其他诸如胶质瘤 【3】、前列腺癌 【4
20、】、卵巢癌 【5】、肝癌 【6】、胰腺癌 【7】以及结肠癌 【8】等均可以CD133 +作为干细胞的分子标记。但就肺癌干细胞而言，对其确切的分子表面标记存有争议。Tirino等通过体外和体内相关实验也证实在肺癌组织中CD34 +/CD326+或者CD133+/CD326+细胞亚群具备干细胞特性，但在肺癌细胞株A549/CALU1/LC12/LC31/LC52,仅CD133 +/CD326+细胞亚群才具备干细胞特性 【9】。但Meng等通 过磁性活细胞分选，得到CD133 +和CD133 -细胞亚群， 经体内和体外实验证实CD133+和CD133 -细胞亚群中含有等量的干 细胞样细胞，说明至少在
21、肺癌细胞株A549和H446上， CD133不能单独作为干细胞的分子标记物 【10】；临床研究报道也认为CD133 的表达与肺癌的预后也无明确的相关性 【11】。因此，本 实验选择药物筛选联合无血清培养逆向诱导富集A549始动细胞。实验中我们通过检测流式细胞表达率证实富集得到的细胞亚群表达 CD133/CD326表面分子；为了更直观地观察体外传代培养后细胞球 CD133/CD326 分子的表达情况，我们用 FITC 标记 的绿色荧光和 CY3 标记的红色荧光抗体对 CD133 和 CD326 进行共聚焦检测， 结果显示第四代的始 动细胞绝大多数表达 CD133/CD326 分子。多向分化潜能和
22、更强的成瘤能力是肿瘤干细胞所具备的重要特性。在分化实验中，CD133 +/CD326+细胞在第二天即可以贴壁生长，其后逐渐成扁平不规则状生长，第六天外形和普通 A549细胞相类似，免疫组织化学 结果证实分化细胞均表达 CK8/CK18 细胞角化蛋抗原，说明其有向普通肿瘤细胞分化的潜能。成瘤实验中我们发现 104级 CD133+/CD326+即能形成移植瘤，而 10 倍量的普通 A549 细胞不能成瘤，说明富集细胞亚群较普通的 A549 细胞具备更强的自我更新增殖能力。总之，通过以上实验我们证实了以 CD133/CD326 标记的富集细胞亚群，具备干细胞的相关特性包括连续的传代成球能力，向普通肿
23、瘤细胞分化的潜能，较普通细胞具备更强的成瘤能力，能够用于肺腺癌干细胞后期生物学特性的研究。参考文献：1 Al-Hajj M., Wicha M.S., Benito-Hernandez A., et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells J. Proc. Natl. USA, 2003, 100(11):3983-88.2 Zabierowski S.E., Herlyn M. Melanoma stem cells: the dark seed of melanoma J. J C O, 2008,
24、 26(6):2890-4.3 Singh S.K., Hawkins C., Clarke I.D., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors J.Nature, 2004, 432(10):396-401.4 Collins A.T., Maitland N.J. Prostate cancer stem cells J. Eur J Cancer, 2006, 42 (14): 1213-8.5 Zhang S. , Balch C. , Chan M.W. et al. Identificati
25、on and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors J. Cancer.res, 2008, 68(4):4311-20.6 Ma S., Tang K.H., Chan Y.P.et al. miR-130b Promotes CD133+ liver tumor initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein1J. Cell. Stem Cell, 20
26、10, 7(13):694-707.7 Hermann P.C., Huber S.L., Herrler T., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer J. Cell Stem Cell, 2007, 1(6):313-23.8 Ricci-Vitiani L., Lombardi D.G, Pilozzi E., et al. Identification and expansion
27、of human colon-cancer-initiating cells J.Nature, 2007, 445(11):111-5.9 Tirino V., Camerlingo R., Franco R, et al. The role of CD133 in the identification and characterisation of tumour initiating cells in non-small-cell lung cancer J. European Journal of Cardio-thoracic Surgery, 2009, 36(1):446-53.1
28、0 Meng X., Li M., Wang X., et al. Both CD133+ and CD133- sub populations of A549 and H446 cells contain cancer-initiating cells J. Cancer Sci., 2009, 100(12): 1040-6.11 Salnikov AV, Gladkich J, Moldenhauer G, et al. CD133 is indicative for a resistance phenotype but does not represent a prognostic marker for survival of non-small cell lung cancer patients J. Int J Cancer, 2010, 126(4):950-8.本文发现紫杉醇联合无血清培养富集得到高表达CD133/CD326分子的细胞亚群，该亚群具备干细胞相关特性，可用于后续肺腺癌干细胞生物学特性的研究。系国科金资助完成，内容完整，图片清晰，讨论紧扣主题。个别文句有修改。建议做论著刊用。
