1、丙型肝炎临床检验技术发展现状与展望【关键词】 HCV 抗原检测 核心抗原 核酸检测技术(NAT) 同时检测 丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的一种重要的世界性传染病1,这种病毒主要经由血液传播，也可能存在其他传播途径如母婴传播、性传播和家庭内接触传播。约有近半数的 HCV 感染传播途径不明确。丙型肝炎的流行呈全球性，是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因。根据 WHO 统计，全球 HCV 的感染率约为 3，估计约 2 亿人感染了 HCV，每年新发丙型肝炎病例约有 3.5 万例。目前尚无治疗丙型肝炎的疫苗，也没有有效的治疗方法。因此防控丙型肝炎传染源及阻断传播途径最为有效的手段就是早
2、期准确诊断并及时发现 HCV 感染者。从传染源和传播途径两方面控制丙型肝炎2。正因为如此世界各国都在不遗余力地研究诊断丙型肝炎的新技术。自 1989 年建立了丙肝病毒抗-HCV 检测方法以来,随着医学检测技术和仪器的不断发展，丙型肝炎的检测技术一直处于不断发展中。到目前为止，丙型肝炎检测技术主要有抗-HCV 检测、HCV-RNA 核酸扩增检测、HCV 核心抗原的检测以及同时检测抗-HCV 和 HCV核心抗原 4 种类型。本文将对丙型肝炎临床检验技术的发展与展望做一综述，现报道如下。 1 抗-HCV 的检测 最早出现的 HCV 检测技术是抗-HCV 的检测。由于 HCV 在病人外周血液中的含量及
3、病毒抗原的含量很低，这就使得用常规方法难以直接检测，经过十几年的不断改进和发展，其检测方法又演变出多种,如:双抗原夹心 ELISA、间接酶联免疫吸附实验(间接 ELISA)、重组免疫印迹法(RIBA)、蛋白芯片检测法以及免疫层析法。在这些方法之中，重组免疫印迹法 (RIBA)是抗体检测的金标准，蛋白芯片检测法主要用于抗-HCV的分型。而 ELISA 由于其操作简单，检测设备廉价，因此成为应用最广的抗体检测技术。 根据出现时间的先后以及使用抗原的不同,抗-HCV 检测技术可分成三代。第一代抗-HCV IgG 试剂盒所用的抗原来自病毒基因组非结构区 (C100)，它的使用使 HCV 的输血感染率下
4、降了 80%以上。但其缺陷是:灵敏度较低,抗体检出时间较晚, 敏感性也较高，达到 8090，但假阳性较高。第二代试剂除了包被 C100 抗原外又加入了 HCV 核心区多肽C223 和非结构区抗原 C33C。抗-C22-3 和抗-C33C 感染后出现较早,敏感性和特异性明显提高，感染后 812 周即可检测。且对 HCV 的特异性较好,二者联合应用可进一步提高检出率。第三代 HCV 抗体 ELISA 试剂中采用了重组的 NSS 多肽，核心区抗原比例相对下降,而相应地增加了非结构区的 NSS 区 C33C 抗原的比例,添加了 NSS 区抗原使其敏感性和特异性得到进一步改善。 上述三代抗-HCV 检测
5、方法多采用间接 ELISA,虽然也有过双抗原夹心直接检测抗-HCV 的报道3,但由于 HCV 抗原存在不稳定性,因此至今仍无商品化的试剂盒。目前我国市售的抗- HCV 试剂盒普遍是采用间接法的第三代抗-HCV ELISA 试剂盒和胶体金试剂盒,其特异性可以达到92%100%。但由于各厂家使用的 HCV 基因重组抗原的质量和各抗原片段包被比例有所不同，从而使各厂家试剂的灵敏度和特异性存在一定的差异，导致抗一 HCV 检测结果的不一致，产生漏检和假阳性等4，未能解决在正常 ALT 者和健康献血者存在的假阳性问题。加上少部分免疫功能不正常的 HCV 感染者，则不能检出抗一 HCV。另外，由于“窗口期
6、”的存在，仍有一定的漏检率5。目前抗-HCV 的检测方法仍有改进的潜力，随着对 HCV 的研究不断深入,更多的 HCV 蛋白会被发现,其中新型核心蛋白和外膜蛋白被认为能有效提高抗-HCV 的灵敏度,但其对抗体的检出率依赖于抗原的获得方法,可能与抗原的构象表位有关6,7。 2 HCV-RNA 核酸扩增检测技术(Nucleic-acid Amplification Technology NAT) 从外周血中检出 HCV RNA 是 HCV 复制活跃的可靠指标,在感染 2个星期内的血清中可检测到 HCVRNA,在感染自然恢复前血清中 HCVRNA 将达到一个高峰8, 目前 NAT 检测被国内外部分机
7、构作为 HCV 感染的确认方法。但 HCV RNA 在达到峰值或重新出现前数天或数周内偶尔也可能检测不到9。同时 HCV RNA 还受进食的影响,易与血中脂质及脂蛋白结合,降低检出率10。因此在一定程度上影响了 NAT 检测方法的完美。另外由于 NAT 检测技术本身在技术和设备上要求较高,且耗时、实验步骤较多(其中任何步骤出现问题均影响其检出),因此该方法也容易因污染而出现假阳性,难以在常规工作或基层实验室推广,限制了其应用的普遍性。 NAT 检测技术同为检测 HCV RNA,但不同的厂商发展出不同的方法和技术,其中 PCR 技术发展得最为迅速,也得到了最广泛的应用,最早的是 RT-PCR,然
8、后是套式 PCR,现在是实时荧光定量 PCR,检测灵敏度特异性不断提高,且实现了全自动定量检测。最新的 NAT 研究有环介导等温基因扩增技术(LAMP)以及基因芯片技术11,12,由于 LAMP 技术操作简单,且无需特殊仪器,具有广阔的应用前景。 3 HCV 抗原的检测 目前报道有两类 HCV 抗原包括非结构抗原和核心抗原的检测可作为 HCV 感染的指标。血清中 HCV 抗原的检测有利于 HCV 感染患者的早期发现,特别是某些免疫功能紊乱、免疫功能低下的患者和某些不产生抗体的携带者。HCV 核心抗原与 HCV RNA 的动力学变化密切相关,可以作为HCV 复制的标志13。 近年来对 HCV 抗
9、原的检测方法的研究不断取得进展,关键点在于单克隆抗体的研制以及抗原抗体复合物解离剂的研究。近期美国 Ortho公司已推出了用双抗体夹心法定性或定量检测血清样品中总的或游离的HCV 核心抗原 ELISA 试剂盒,与 RT-PCR 方法相比，具有操作简单、耗时短、对实验环境要求较低以及假阳性率低等特点,在临床上可用于 HCV 血清学转换前的早期急性丙型肝炎诊断、抗-HCV 阳性感染者的病毒血症分析以及 HCV 感染者治疗前后病毒血症追踪分析等14。HCV 核心抗原存在的时间较短(约 2770d),所以 HCV 核心抗原的检测还要结合抗-HCV 的结果。同时 HCV 核心区基因的变异也可能影响了 H
10、CV 核心抗原的检测,比如HCV 核心区 49 位氨基酸的突变就降低了抗原测定的敏感性15。改进现行试剂盒的主要途径是提高单克隆抗体对于天然抗原的构象表位的亲和力。 对于非结构蛋白的检测主要为 NS3、NS4 和 NS5 位点的蛋白16,由于这部分蛋白出现变异的概率较大,目前仅见报道。 4 同时检测抗-HCV 和 HCV 核心抗原 联合检测抗原抗体的思路是 HCV 筛查试剂盒和血清学检测的发展方向。目前主要把 HCV 核心抗原和外周蛋白抗体及部分核心抗体相结合的检测试剂盒17。HCV 核心抗原是 HCV 感染者体内出现的早期感染指标，几乎与 HCV RNA 同时出现，核心抗原和 HCV RNA
11、 的动力学变化密切相关。 HCV 核心抗原检测用双抗体夹心法定性或定量检测血清样品中的HCV 核心抗原。该方法不受被检测样品中抗-HCV 的干扰,检测结果准确可靠。可用于 HCV 早期急性丙型肝炎诊断，抗-HCV 阳性感染者的病毒血症分析以及 HCV 感染者治疗前后病毒血症追踪分析18。目前已有两家商品化的试剂盒面世,但是这两种试剂盒都使用两步检测,而且检测时间都较长（超过 2h）,不利于快速的筛查和 POCT 工作。另外这两种试剂盒都不能区分阳性样本中抗原和抗体的存在情况,不利于进一步分析病情。 综上所述,无论 HCV 检测技术的怎么发展，都必须秉着快速、准确和有效这些原则。由此可以预测未来
12、 HCV 检测技术会朝着两个方向发展,一方面是要求技术上的快速、精确反应 HCV 感染状况的检测，降低假阳性的概率，使人们尽早发现病情。另一方面是有助于治疗 HCV 和疗效观察的检测，不断优化治疗 HCV 的方法，争取早日研究出治疗 HCV 的疫苗。对于第一种方向,人们较为容易理解,因为随着实验技术的不断进步,HCV 检测的灵敏度逐步提高，HCV 感染的“窗口期”将不断缩短。第二种方向也是当前分子诊断领域的方向,人们可以通过新的检测方法或是几种 HCV 检测方法的综合应用来判断病人的病情,从而给予临床治疗提供及时帮助和指导。 参 考 文 献 1 张贺秋丙型肝炎病毒核心抗原检测技术国内外临床研究
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