1、玻璃粘连蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响作者：王明明 叶发刚 葛银林 【摘要】 目的 体外分离纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC） ，研究玻璃粘连蛋白（VN）在 rMSC 向成骨方向分化过程中的作用。方法 贴壁分离培养法分离纯化 rMSC，观察第 1、3、5、8、10 代细胞的增殖情况，并绘制出生长曲线。选第 3 代细胞用以 VN 包被的培养板培养，每 4 d 检测碱性磷酸酶活性及钙结节的形成。结果 经贴壁筛选法分离的 rMSC生长曲线呈 S 形，第 3、4、5 代细胞排列具有典型的漩涡状结构；细胞表达 CD44、CD90，而不表达 CD34。用以 VN 包被的培养板培养 12 d，
2、碱性磷酸酶染色呈阳性，硝酸银染色显示有钙结节形成。结论 VN 有诱导rMSC 向成骨方向分化的作用。 【关键词】 骨髓;间质干细胞；玻璃粘连蛋白;细胞分化 ABSTRACT Objective To isolate, purify and cultivate the rat mesenehymal stem cells (rMSCs) in vitro, and study the effect of vitronectin (VN) on osteogenic differentiation of rMSCs. Methods rMSCs were isolated and purified
3、 by wall adhesion culture procedure in vitro. The growth curve of cell proliferation was obtained based on the observation of the proliferation status of 1st, 3rd, 5th, 8th, and 10th generation. The cells of the 3rd generation were cultured in culture plates coated by VN, and calcifying nodule and a
4、lkaline phosphatase (ALP) activity checked every four days. Results The rMSCs growth curve appearred as S form, and 3rd,4th and 5th generation manifested as typical whirlpool structure. These cells expressed CD44 and CD90, but not CD34. The cells cultured for 12 days in cultureplates and coated with
5、 VN showed positive ALP expression and calcifying nodules. Conclusion Vitronectin pocesses a potential of inducing RMSC towards osteogenic differentiation. KEY WORDS bone marrow; mesenchymal stem cells; vitronectin; cell differentiation 骨髓间充质干细胞（MSC）为骨髓中一群多能干细胞，在不同的因素诱导下可以分化为不同的细胞。启动 MSC 分化的确切因素尚不十分
6、清楚，周围环境中某些可溶性诱导因子已被成功鉴定，而周围不可溶性成分对成骨诱导的作用相对关注较少。本实验主要研究构成细胞外基质主要成分的玻璃粘连蛋白（VN）在 MSC 向成骨分化过程中的作用，以探讨 MSC成骨分化的确切因素。 1 材料和方法 1.1 实验材料 Wistar 大鼠，2 月龄，由青岛市药品检验所提供。VN（武汉博士德生物工程有限公司）,LDMEM 低糖培养基(GIBCO 公司)， 胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司)，胰蛋白酶(SIGMA 公司)，羊抗大鼠CD34FITC 、CD44FITC 、CD90FITC （北京中山生物公司） 。 1.2 实验方法 1.2.1 大鼠骨髓间充质
7、干细胞（rMSC）的体外分离培养 取 2 月龄 Wistar 大鼠，颈椎脱臼处死，无菌条件下取出其股骨，用LDMEM 冲出骨髓，离心去除上清及脂肪，所得细胞悬液以 1.0108/L的细胞密度接种于 75 mL 培养瓶中，在含体积分数 0.15 胎牛血清LDMEM 完全培养液中，37 、体积分数 0.05 CO2、饱和湿度条件下培养，3 d 后首次换液，去除未贴壁细胞。以后每 23 d 换液 1 次，待贴壁细胞融合 90%时，以 2.5 g/L 胰蛋白酶消化、传代。贴壁细胞融合 90%时即传代 1 次，传至第 3 代时进行实验。 1.2.2 rMSC 的生长曲线绘制 分别取第 1、3、5、8、1
8、0 代细胞，用 2.5 g/L 胰蛋白酶消化后加入LDMEM 完全培养液，调整细胞密度至 1.0107/L，接种于 5 个 24 孔板，每孔加细胞悬液 1.0 mL。每天每板取 3 孔消化，制成细胞悬液，混匀，计数并取平均值，连续 9 d，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制生长曲线。 1.2.3 rMSC 的鉴定 形态学观察:在倒置显微镜下定期观察细胞生长情况。细胞表面标志鉴定: 取第 3 代细胞消化、计数、离心，加入 200 L PBS 制成细胞悬液。设置阴性对照，加入羊 IgG1FITC; 其他管分别加羊抗大鼠CD34FITC 、CD44FITC 、CD90FITC 以及细胞与荧光素 共轭
9、抗体抗CD29、CD34、CD90，在黑暗中孵化 15 min。流式细胞仪检测细胞表面抗原表达情况。 1.2.4 rMSC 与 VN 共培养及相关指标检测 在 rMSC 传代 3 次后，将指数生长期细胞用 LDMEM 调细胞的密度为3.0103/cm2，接种于用纯化的 VN 包被的 24 孔培养板中，以成骨诱导液为阳性对照，以含体积分数 0.15 胎牛血清 LDMEM 完全培养液为阴性对照，每 3 d 换液 1 次，在培养至 4、8、12 和 16 d 时分别进行碱性磷酸酶染色和钙离子沉淀测定。碱性磷酸酶染色：向培养板中加入双蒸水配制的萘酚 ASMX 磷酸盐和 Fast blueRR 溶液，孵
10、育，显微镜下测定染料沉积情况。钙离子沉淀的测定：用 30 g/L 的多聚甲醛固定细胞 30 min，双蒸水洗 2 次，暗处与 50 g/L 的硝酸银溶液孵育 10 min，双蒸水洗后暴露于强光下 1 h，计数染色细胞沉积颗粒的数目和大小。 2 结 果 原代培养细胞 12 h 可见细胞贴壁， 3 d 后大部分细胞贴壁，第 1 次换液后细胞 4 h 贴壁，细胞呈多角形、菱形，可见集落形成;910 d 细胞间相互融合达 90%。传代后细胞 4 h 贴壁，生长迅速，细胞呈较为均一的梭形、多角形，并呈漩涡状排布。 rMSC 生长曲线呈 S 形，第 35 代增殖迅速，1 代和 8 代次之，10 代生长明显
11、减慢（图 1） 。分离纯化的细胞不表达造血细胞表面标志 CD34，而强表达 CD44、CD90，说明所提取、纯化的细胞是 MSC，而不是成纤维细胞或造血干细胞。诱导组第 8 天细胞碱性磷酸酶染色可见棕黑色颗粒，第 12 天棕黑色颗粒明显增多增大，提示碱性磷酸酶染色阳性，而阴性对照组无此颗粒。硝酸银染色诱导组呈多量黑色颗粒，而阴性对照组无此颗粒，阳性对照组颗粒更为粗大。 3 讨 论 近年来研究表明，MSC 是一种具有多向分化潜能的干细胞，特定条件下可向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等分化12 。体内多种影响其分化的可溶性因子已被分离鉴定，如 MSC 在含有维生素 C、地塞米松、 磷酸甘
12、油的培养基中培养时，细胞能够产生碱性磷酸酶,并具有矿化能力,具备成骨细胞的生物学特性3 。 在近年的实验研究中，人们过多地关注成骨基质在 MSC 分化过程中的作用，却忽略了细胞外基质结合行为对其分化的影响。有报道证明，胶原在软骨形成过程中表达最高，而胶原在骨化阶段沉积最多4 。在体外实验中，MSC 培养于胶原基质上时会发生成骨分化，并且需要与胶原结合整合素 21 的相互作用5。细胞外基质蛋白通过结合细胞表面特异的整合素受体而影响细胞的生物学行为，这些受体能启动细胞内信号通路，控制基因表达、细胞骨架形成和细胞形态。显然，作为细胞外基质主要成分的胶原在 MSC 成骨分化过程中起了一定的作用。 本实
13、验采用全骨髓培养法，将 rMSCs 直接加入培养瓶中而未先进行分离。由于 rMSCs 贴壁生长，而造血细胞悬浮生长，经 3 代换液培养后能基本去除未贴壁细胞3 。基于细胞外基质在 MSC 成骨分化过程中起一定作用，用构成细胞外基质主要成分的 VN 研究 rMSC 与细胞外基质结合对 rMSC 成骨分化的影响，并采用碱性磷酸酶染色6 、硝酸银染色证明成骨分化的程度。结果显示，rMSC 可与 VN 正常结合，并在共同培养第8 天出现成骨分化倾向，第 12 天成骨分化明显，细胞呈典型成骨细胞表型，碱性磷酸酶活性增高，硝酸银染色显示有大量钙结节形成，证明rMSC 与细胞外基质结合可能参与了成骨分化过程
14、。rMSC 是如何将与细胞外基质结合转化为 MSC 细胞分化行为，尚需进一步研究。 【参考文献】 1KNIPPENBERG M, HELDER M N, DOULABI B Z, et al. Adipose tissuederived mesenchymal stem cells acquire bone celllike responsiveness to fluid shear stress on osteogenic stimulationJ. Tissue Engin, 2005,11(1112):17801788. 2JIANG Y, JAHAGIRDAR B N, REINHAR
15、DT R L, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrowJ. Nature, 2002,418:4149. 3刘斌钰,李宁毅,樊功为,等. 大鼠骨髓间充质干细胞的培养鉴定及向成骨细胞诱导分化研究J. 齐鲁医学杂志, 2007,22(3):215217. 4BORTELL R, BRAONE L M, TASSINARI M S, et al. Gene expression during endochondral bone development: evidence for coordinat
16、e expression of transforming growth factor beta 1 and collagen type J. J Cell Biochem, 1990,44(2):8191. 5CATELAS I, SESE N, WU B M, et al. Human mesenchymal stem cell proliferation and osteogenic differentiation in fibrin gels in vitroJ. Tissue Eng, 2006,12(8):23852396. 6叶发刚,夏长所,张卫兵,等. 兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定J. 青岛大学医学院学报, 2006,42(4):330332.
