1、补阳还五汤对鼠脑缺血再灌注后脑组织兴奋性氨基酸的作用作者：耿小茵，赖真，邓常青，张阮章，王沙燕 【关键词】 补阳还五汤 摘要：【目的】观察补阳还五汤对沙土鼠脑缺血及再灌注损伤与脑组织兴奋性氨基酸(EAA)的影响。 【方法】复制沙土鼠双侧颈总动脉夹闭脑缺血模型，于缺血后 15?min 再灌注 48?h，取脑组织测定天冬氨酸(Glu)、谷氨酸(Asp)、-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)的含量。 【结果】缺血 15?min 后，脑组织 Glu、Asp、GABA 含量升高(005 或001)，补阳还五汤可降低脑组织 Glu 含量(005)；缺血 15?min再灌注 48?h 后，脑组织 Glu
2、 及 Asp 含量升高(005)，补阳还五汤可使脑组织 Glu 含量降低(005)。 【结论】补阳还五汤抗缺血性脑损伤的作用机理可能与其对抗脑缺血及再灌注后 EAA 的升高有关。 关键词：脑缺血/中药疗法； 再灌注/中药疗法；补阳还五汤/药理学； 兴奋性氨基酸类/分析；疾病模型，动物 兴奋性氨基酸(EAA)在脑缺血及其再灌注后的脑组织损伤中具有重要作用 。研究证实，补阳还五汤是治疗中风的常用药物，为了探讨其对脑缺血损伤后的影响，我们用沙土鼠复制脑缺血及再灌注模型，观察补阳还五汤对脑缺血再灌注后 EAA 的影响。现报道如下。 1 材料和方法 11 仪器和试剂 补阳还五汤原方由黄芪 60?g、赤芍
3、 9?g、川芎 6?g、当归 9?g、地龙9g、桃仁 9?g、红花 9?g 组成。上述药物由本院药剂科一次性购齐并鉴定，各药按比例混合，沉淀法制备成注射剂，生药含量为 2?kg/L，用时以生理盐水稀释成 400?g/L。仪器包括 GL-20A 型高速冷冻离心机(湘仪总厂离心机厂)、LC-6A 高效液相色谱仪和 RF-530 荧光检测仪(日本岛津)。谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、-氨基丁酸(GABA)和甘氨酸(Gly)标准品，纯度 999%(质量分数)，均为 Sigma 公司产品；其他试剂均为国产分析纯。12 动物实验 清洁级蒙古沙土鼠 73 只(38 只用于观察死亡率，35 只用于检测
4、氨基酸含量)，体重 60100?g，雌雄各半，由卫生部上海生物制品研究所动物中心提供，合格证号为医动字号第 02-21-8 号。沙土鼠随机分为假手术对照组(假手术组)、缺血模型对照组(缺血模型组)、缺血加补阳还五汤药液组(缺血加原方组)、缺血再灌注模型组(再灌注模型组)、再灌注加补阳还五汤原方组(再灌注加原方组)。缺血加原方组和再灌注加原方组均腹腔注射(ip)补阳还五汤药液 40?g/kg；假手术组、缺血模型组和再灌注模型组均 ip 等容量生理盐水，连续给药 2?d。末次给药后 30?min，各组动物 ip 盐酸氯氨酮 60?mg/kg 麻醉，复制沙土鼠双侧颈总动脉夹闭模型 ，分离两侧颈总动脉
5、，除假手术组 16 只动物外，各组均以无创性小动脉夹夹闭两侧颈总动脉造成脑缺血。缺血模型组、缺血加原方组于缺血 15?min 后处死，取脑置冰箱内保存待测；再灌注模型组、再灌注加原方组在缺血 15?min 后松开动脉夹行再灌流，缝合皮肤继续饲养，3 组均于再灌流后 12、24、36?h 按上述剂量 ip 药物或生理盐水，再灌流48?h 处死动物，取脑待测；假手术组不结扎两侧颈总动脉，其他操作与再灌注各组相同。 13 观察指标及方法 各组动物处死后取出双侧脑组织，在冰台上迅速分离双侧前脑皮质和海马，以冰生理盐水冲洗后除去残血，吸干后称重，按 19 比例加入无水乙醇，以高速匀浆机在冰浴下制成 10
6、0?g/L 脑匀浆液，匀浆条件为10?s/次，共计 4 次。将匀浆液以 3500?r/min(4?)离心 15?min，分离上清液于-30保存待测。测试前标本复溶，再以 1000?r/min(4?)离心10?min，取上清液，检测条件及方法按 Chen 等建立的高效液相色谱法进行，进样量为 100?L。 14 统计分析 测定数值用(s)表示，方差齐者采用方差分析和 q 检验分析，方差不齐者采用秩和检验分析；计数资料采用 分析。 2 结果 21 缺血 15?min 各组动物死亡率比较 沙土鼠 38 只随机分为假手术组 8 只，缺血模型组 17 只，缺血加原方组 13 只。缺血模型组 17 只动物
7、有 6 只死亡，死亡率为 353%；缺血加原方组 13 只动物中 1 只死亡；死亡率为 77%；假手术组均无死亡，缺血模型组死亡率高于其他两组(001)。 22 各组脑组织 Glu 含量比较 表 1 显示，缺血 15?min 后，缺血模型组脑组织 Glu 含量高于假手术组(005)；缺血加原方组脑组织 Glu 含量低于缺血模型组(005)，与假手术组间差异无显著性意义(005)。再灌注 48?h 后，再灌注模型组脑组织 Glu 含量高于假手术组(005)，与缺血模型组比较无显著性差异(005)；再灌注加原方组脑组织 Glu 含量低于再灌注模型组(005)，与假手术组比较无显著性差异(005)。
8、 23 其他氨基酸在各组脑组织的含量比较 表 1 显示，除缺血模型组及再灌注模型组脑组织 Asp、GABA 含量高于假手术组(005 或001)外，其他各组比较均无显著性意义(005)；各组脑组织 Gly 含量比较，差异均无显著性意义(005)。表 1 补阳还五汤对脑缺血再灌注模型沙土鼠脑组织氨基酸含量的影响（略） 3 讨论 兴奋性氨基酸主要是指谷氨酸(glutamate,Glu)和天冬氨酸(asparate,Asp)。脑缺血缺氧时大量 EAA 尤其是 Glu 呈暴发性释放，EAA受体过度激活，使一些受体在正常生理刺激下引起的第二信使效应得到放大，突触后神经元过度兴奋、溃变、坏死。目前已知兴奋
9、性突触传递的受体有 AMPA(Q)受体、海人藻酸(KA)受体和 N-甲基-D-门冬氨酸 NMDA受体 3 个亚型，尤以 NMDA 受体在发生兴奋性神经毒性中更为重要- 。 脑缺血时，缺血神经元大量释放的 EAA 尤其是 Glu 对神经元的损伤起关键作用。由于 EAA 使神经元持续去极化，增加了神经元内 Glu 等的大量释放，又因脑缺血后三磷酸腺苷(ATP)降解，依赖能量而重吸收 Glu的机制衰竭，影响 Glu 摄取功能，甚至出现 Glu 向细胞外液转移，如此恶性循环，突触间隙持续高浓度的 Glu 就引起兴奋性神经毒性 。故拮抗 EAA 兴奋性毒性，包括抑制其过度释放，促进其再摄取，以及抑制其受
10、体活性，对脑缺血损伤具有防治作用。虽然目前已证实了一些药物如苯环利定、地西平等 NMDA 受体拮抗剂具有较好的防治脑缺血的作用，但均存在不同程度的副作用，难以被临床接受- ；同时，脑内还存在抑制性氨基酸(IAA)，主要指 -氨基丁酸(GABA)和甘氨酸(Gly)，为中枢神经系统内的抑制性递质，可抑制神经元兴奋，减少由于 EAA 造成的神经细胞损伤。 本研究表明，缺血 15?min 和再灌注 48?h 后，脑组织 Glu 和 Asp 含量均增加，表明 EAA 的兴奋性毒性参与了脑缺血后早期细胞损伤和迟发性神经损伤的发生过程。在缺血 15?min 后，脑组织 GABA 含量升高，可能是缺血后代偿性
11、释放增加的结果。 本研究预先给予补阳还五汤原方，可使沙土鼠脑缺血后死亡率降低，使鼠脑缺血 15?min 后脑组织 Glu 含量降低，同时又可降低鼠脑再灌注 48?h后脑组织 Glu 含量。以上结果表明，补阳还五汤原方可对抗缺血性脑损伤，既可防止缺血时 EAA 的升高，又可防止再灌注时 EAA 的升高。提示补阳还五汤抗缺血性脑损伤的作用机理可能与其对抗脑缺血及再灌注后EAA 的升高有关。 参考文献： 陈维洲，芮耀诚脑血管疾病基础与临床研究 济南：山东科技出版社，199312-25 徐叔云，卞如濂，陈修药理实验方法学 北京：人民卫生出版社，19821060 Chen B M,Xia L M,Zha
12、o R Q.Determination of N，Ndimethylarginine in human plasma by highperformance liquid chromatography Journal of Chromatography B,1997,692:467. Iversen L,Mulvihill E,Haldeman B,et al.Changes in metabotropic glutamate receptor mRNA levels following global ischemia:increase of a putative presynaptic sub
13、type(mGluR)in highly vulnerable rat brain areas J Neurochem,1994,63(2):625. PellegriniGiampietro D E,Gorter J A,Bennett M V L,et al.The GluR(GluB)hypothesis:Capermeabie AMPA receptors in neurological disorders Trends Neurosci,1997,20(10):464. Muir K W,Lees K R.Clinical experience with excitatory amino acid antagonist drugs Stroke,1995,26(3):502. Rogawski M A.The NMDA receptor,NMDA antagonists and epilepsy therapy Drugs,1992,44(3):279.
