1、藏药红景天对大鼠肺纤维化保护作用及机制探讨作者：胡晓波 程德云 穆茂 聂莉【摘要】 目的观察红景天对肺纤维化大鼠肺组织 I 型胶原、转化生长因子 1（TGF-1）及其信号通路分子 Smad4 表达的影响，探讨红景天对大鼠肺纤维化的防治作用与机制。 方法健康 SD 大鼠 40 只随机分为4 组：模型组（A 组） ，正常对照组（B 组） ，红景天 14 d 治疗组（C 组） ，红景天 28 d 治疗组（D 组）各 10 只。博莱霉素（BLM）气管内滴入建立大鼠肺纤维化模型，正常对照组气管内滴入生理盐水。在造模的第 2 日治疗组予红景天 0.21 g/kg 灌胃干预，于第 14，28 日取肺组织，运
2、用组织芯片结合图象分析技术，通过苏木素-伊红（HE）染色观察肺组织病理学改变，用免疫组化检测 I 型胶原蛋白和 TGF-1 的表达，实时荧光定量 RT-PCR 检测 I 型胶原和 TGF-1 的 mRNA 表达，原位杂交技术对Smad4 mRNA 进行定位定量分析。 结果红景天在两时相皆抑制 I 型胶原，TGF-1 的表达。C 组 I 型胶原蛋白的 IOD 值为（0.3620.241） ，D 组 I型胶原蛋白 IOD 值为（0.3340.122） ，与 A 组（0.5130.384）相比有统计学意义（P 均0.05） 。C 组 TGF-1 蛋白的 IOD 值为（0.0620.013） ，D 组
3、 TGF-1 蛋白 IOD 值为（0.0580.011） ，与 A 组（0.1000.005）相比有统计学意义（P 均0.05） 。C 组 I 型胶原mRNA 相对表达量为（0.0410.017） ，D 组 I 型胶原 mRNA 相对表达量为0.0400.021，与 A 组 0.0710.054 相比有统计学意义（P 均0.05） 。C 组 TGF-1 mRNA 相对表达量为（0.00250.0013） ，D 组 TGF-1mRNA相对表达量为（0.00300.0005） ，与 A 组（0.01700.0157）相比有统计学意义（P 均0.05） 。肺组织 Smad4 mRNA 表达呈局灶性，
4、在炎症和胶原沉积部位表达较明显，而治疗组和模型组比较无统计学意义（P 均0.05） ；治疗组 Smad4 mRNA 表达量与正常对照组（0.1650.099）比较亦无统计学意义（P0.05） 。 结论 红景天对大鼠肺纤维化具有一定治疗作用，其机制可能是通过抑制 I 型胶原及 TGF-1 表达，从而干扰 TGFSmads 信号通路对基因表达、蛋白合成的调节而实现的。 【关键词】 红景天 肺纤维化 型胶原 转化生长因子 1 组织芯片 实时荧光定量 PCRAbstractObjectiveTo study the protective effect and mechanism of integrip
5、etal rhodiola herb(IRH) on rats with pulmonary fibrosis. MethodsForty SD rats were divided randomly into four groups (Group A：fibrosis model group, 10 rats. Group B：normal group, 10 rats. Group C：14 day-treatment group with IRH, 10 rats. Group D：28 day-treatment group with IRH, 10 rats). In the mode
6、l group and the treatment group, pulmonary fibrosis was reproduced by the intratracheal injection of bleomycin (BLM). In the normal control group, normal saline was given intratracheally. IRH was administered intragastricly from day 1 till day 28 after modeling with a dose of 0.21 g/kg in the group
7、C and D, while the normal saline was given intragastricly in the other groups. On the 29th day, rats were sacrificed. HE staining were undertaken after lung tissue was made into tissue microarray slices. Collagenand transforming growth factor beta 1(TGF-1) were tested by methods of immunohistochemic
8、al staining and real time quantitative PCR. Expression of Smad4 mRNA was tested by in situ hybridization. ResultsThe expressions of Collagenin group C(0.3620.241) and group D(0.3340.122) were much lower than that of group A (0.9350.377，P0.05). The expressions of TGF-1 in group C(0.0580.011) and grou
9、p D(0.0620.013) were much lower than that in group A (0.1000.005，P0.05). The expressions of CollagenmRNA in group C(0.0410.017) and group D(0.0400.021) were much lower than that of group A (0.0710.054，P0.05). The expressions of TGF-1 mRNA in group C(0.00250.0013) and group D(0.00310.0005) were much
10、lower than that in group A (0.01700.0157，P0.05). The IOD of Smad4 mRNA in treatment groups were no significant different from that in model group (P0.05). ConclusionSignificant enhancement of the expressions of Collagenand TGF-1 were observed in lung tissue of rats with pulmonary fibrosis. IRH has a
11、 preventive effect against pulmonary fibrosis. Inhibitting the expressions of pulmonary Collagenand TGF-1 may be one of the mechanisms.Key wordsIntegripetal rhodiola herb； Pulmonary fibrosis； Collagen transforming growth factor beta 1； Tissue microarray； Real-time quantitative polymerase chain react
12、ion(real-time Q-PCR)红景天为景天科红景天属多年生草本植物，全世界共有 96 种，分布在北半球的高寒地带。其中我国有 73 种，主要分布于东北、华北、西北及西南，有较为广泛的临床药用价值1 。目前较为常用的有高山红景天和西藏圣地红景天，尤以生长在西藏的圣地红景天(藏语：苏罗玛宝)为上品。近年来对红景天药理学和临床应用研究较多，目前已从红景天中分离鉴定出化学成分主要包括：红景天苷、酪醇、黄酮类化合物以及淀粉、蛋白质、脂肪、酚类化合物和微量元素铁、铝、锌、钴、镉、钛、铜、锰等2 。红景天的胶囊制剂诺迪康是采用现代科学方法，选用生长在西藏高原 (海拔高度 3 5005 000 m
13、地带)圣地红景天为原料精制而成，其主要成分由红景天苷、酪醇、多种黄酮、18 种氨基酸、多种微量元素和丰富的维生素 A，D，E 等组成。目前临床主要用于治疗和预防冠心病心绞痛，用于肺纤维化治疗的报道不多3 。肺纤维化是一个复杂的病理生理过程，是肺对各种原因所致肺损伤的创伤愈合反应，最终肺内结缔组织增生、沉积形成纤维化。在纤维化形成过程中，转化生长因子 1（TGF-1）起重要作用，它能趋化、刺激成纤维细胞合成间质生长因子和细胞外基质成分46 ，形成胶原并大量沉积导致器官纤维化。近年来，传统中药治疗肺纤维化成为抗肺纤维化领域的研究热点之一。我们选用藏药红景天，通过观察其对肺纤维化大鼠肺内 I 型胶原
14、，TGF-1 及其信号通路分子 Smad4 表达的影响，旨在探讨红景天对肺纤维化的防治作用及机制。1 材料与方法1.1 材料 1.1.1 动物和试剂SD 健康大鼠 40 只，雌雄各半，体重 150250 g，购于四川大学华西动物中心；红景天（诺迪康，批号：040209，四川诺迪康威光制药有限公司生产） ；博莱霉素(批号 Y32480，15 mg/支，日本化药株式会社)，I 型胶原、TGF-1 免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，RT-PCR 试剂盒 (立陶宛 MBI 公司)，引物探针(上海生物工程有限公司)，Trizol(美国 MRC 公司)，Smad4 mRNA 原位杂交试剂盒(武
15、汉博士德生物工程有限公司)。1.1.2 仪器与设备FTC-2000 型荧光定量基因扩增仪(加拿大枫岭公司)，美国 Image-pro plus 专业图像分析软件系统(美国 Media Cybernetics 公司)。1.2 方法1.2.1 动物处理按性别及体重分为 4 组，模型组（A 组） ，正常对照组（B 组） ，红景天 14 d 治疗组（C 组） ，红景天 28 d 治疗组（D 组）各 10 只。采用博莱霉素造模6 ，方法如下：大鼠经氯胺酮麻醉后，无菌操作下切开大鼠颈前皮肤，钝性分离气管，经气管灌入博莱霉素（5 mg/kg，溶于 0.3 ml 生理盐水）后，立即将大鼠直立并左右旋转使药物均
16、匀灌入双肺，缝合皮肤。对照组大鼠经气管内灌入同等体积的生理盐水。第 2 天 C，D 组用红景天 0.21 g/kg 灌胃，A，B 组用同等体积生理盐水灌胃，共 28 d。1.2.2 标本收集 A，B 组动物于给药后第 29 天称重后用速眠新1 ml/kg（846 合剂）肌注麻醉后处死。C 组大鼠于第 15 天，D 组大鼠于第 29 天处死。取右肺下叶用锡薄纸包裹后于液氮罐中速冻保存；经左主支气管灌注 4%多聚甲醛直至左肺完全膨胀后，将其置于 4%多聚甲醛(含 0.1%DEPC)中固定，制成石蜡块。1.2.3 制作组织芯片用石蜡先于包埋盒中制备空白蜡块，2 mm 口径打孔器于空白蜡块上按设计阵列
17、打 30 孔。再用打孔器于每个标本蜡块上的组织区域钻孔切割取直径 2 mm 点柱。将点柱捅出打孔器后，放于空白蜡块的孔洞内。空白蜡块上的孔洞全填上点柱后微熔蜡块，使点柱与周围石蜡溶合，然后将已完全融化的石蜡倒入包埋盒将外露的点柱融盖，再用钢针于酒精灯上加热后修整融合点柱，排出气泡，再将包埋框放于包埋盒上，倒入少量熔化石蜡使包埋框与蜡块融合并作好标记，放于冰箱 4冷却。取出蜡块，含 30 个点阵的组织芯片蜡块制作完成。1.2.4 石蜡切片行苏木素伊红染色观察肺部病理改变程度用免疫组化（SP）法检测大鼠肺组织 I 型胶原和 TGF-1 表达，实验操作依照免疫组化试剂盒说明书进行。原位杂交检测 Sm
18、ad4 mRNA 表达，依原位杂交试剂盒说明书进行。1.2.5 图像采集、处理及定量分析由 TE2000-u 倒置生物显微镜、COOLPIX450 高级数码像机及 Image-pro plus 专业图像分析软件构成图像采集和分析系统。定量方法：于切片左右上下 4 个视野各采集 1 张 100倍的图像，自动计算型胶原、TGF-1 和 Smad4 mRNA 积分光密度(IOD)值。4 张图像的 IOD 平均值作为该片指标的代表值。1.2.6 实时荧光定量 RT-PCR 检测肺组织型胶原、TGF-1 mRNA 表达先提取组织总 RNA，步骤：取新鲜冷冻保存的组织，剪取5080 mg 放入玻璃匀浆器中
19、，先用超声碎化组织后加入 1 ml Trizol 制成匀浆, 室温放置 5 min，使样品充分裂解，将匀浆液转入 1.5 ml EP 管中，4，12 000 r/min 离心 10 min。将上清液移入另一 EP 管，室温放置 5 min，加 200 l 氯仿，盖紧盖子，用力振荡 15 s，放置 3 min，待其自然分层。12 000 r/min 离心 10 min，然后吸取含总 RNA 的上层水相至另一离心管中。加 0.5 ml 异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀 10 min。4，12 000 r/min 离心 10 min，在管底可见胶状 RNA 沉淀，弃上清。加 75乙醇 1 ml，颠倒混
20、匀，洗涤 RNA。4，7 500 r/min 离心 5 min，去掉乙醇留沉淀，共 2 次。空气中干燥 5 min，加 100 l 经 DEPC处理的灭菌双蒸水，于-80冷冻保存。两步法 RT-PCR 扩增目的基因：（1）引物：型胶原上游引物5 CCTCCTGGCTTCCCTG 3，下游引物5CAGCACCAGGGTTTCCAGCA3，TaqMan 探针5CTCACCACGCACACCCTG3。TGF1 上游引物 5 actactgcttcagctccaca3，下游引物5gtgtccaggctccaaatgt3，TaqMan 探针5ccaagggctaccatgccaac 3。内对照基因 GA
21、PDH 上游引物5tgggtgtgaaccacgagaa3，下游引物5ggcatggactgtggtcatga3，TaqMan 探针5ctgcaccaccaactgcttagc3。 （2）制备模板 cDNA：在 0.2mlEP 管中加入 2 l 总 RNA，再加入 DEPC-H2O，使总体积为 8l。加入 0.5 l 核糖核酸酶抑制剂，2 l 随机引物，小心混匀。65保温 5 min，室温放置 10 min，室温高速离心 5 s，将所有溶液收集到管底。按次序分别加入下列试剂：4 l 5First-strand Buffer，0.5 l ribonuclease inhibitor，2 l dN
22、TP Mix，2l DTT，1 l MmuLV Reverse Transcriptase，混匀，37保温 1 h。90处理 5 s，冰上冷却，室温高速离心 5 s，将所有溶液收集到管底，用于 PCR 扩增或-20保存备用。 （3）扩增目的基因：制作标准曲线：用假定初始拷贝数（X）的 cDNA 模板按 10 倍梯度进行稀释，制成标准模板系列，自每个稀释模板中取样 5 l ，分别加入 30 l 的反应体系中，行实时荧光定量 PCR，具体步骤如下：3 l 10Buffer，3 l 25 mmol/L MgCl2，0.9 l 10 mM dNTP，1 l 10 mol/L 上游引物，1 l 10 m
23、ol/L 下游引物，1 l 10 mol/L TaqMan 探针，0.3 l TaqDNAPolymerse(5U/l)，14.8 l DEPC-H2O，5 l cDNA 模板，总体积 30 l。反应体系在 FTC2000 型荧光定量 PCR 仪上进行。扩增条件如下：94预变性 1 min，94变性 10 s，55退火 30s，72延伸 1 min，共 45 个循环。45 个循环的扩增反应结束后，系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数进行分析绘制每一反应管的扩增动力学曲线。然后以每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（Ct 值）为纵坐标，以标准品的各稀释度的起始
24、靶 DNA 拷贝数的对数值为横坐标做标准曲线。待测组织目的基因相对拷贝数的测定：将逆转录得到的 cDNA 样品中各取 5 l，加入和上面完全相同的反应体系中，在同样的反应条件下行 PCR 扩增。收集数据，绘制动力学曲线，测定各样品的 Ct 值与标准曲线进行比较，根据说明书上的步骤计算得出待测样品的相对拷贝数。在 PCR 反应过程中，设定无 cDNA 样品的空白管作为阴性对照。据上述方法分别计算出各个标本待测靶基因和内对照基因的相对拷贝数，再将各待测样本靶基因的相对拷贝数除以其内对照基因的相对拷贝数，获得校正拷贝数，然后转化为自然对数，计算各均值，作为该标本的代表值。1.3 统计学处理 全部资料
25、采用 SPSS11.0 统计软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA） ，数据采用s 表示。2 结果2.1 镜下组织病理学结果 肺组织 HE 染色见 C 组肺组织无明显异常，A 组大鼠肺内病变范围广，表现为明显的肺泡炎，肺泡腔和肺间质均有大量的多核及单核细胞浸润和红细胞渗出。大量肺泡结构破坏或消失，肺泡间隔增厚，有胶原沉积及斑片状的纤维化形成。C，D 组肺纤维化程度明显减轻，炎性细胞浸润和胶原沉积较 A 组少。2.2 各组大鼠肺组织型胶原表达量比较 A 组型胶原蛋白表达与 B 组相比较明显增高（P 0.05） 。C，D组的型胶原蛋白和 A 组比较明显减少（P 0.05） 。C，D，B
26、 3 组之间比较无统计学意义（均*P0.05） ，见表 1。A 组型胶原 mRNA 表达与 B 组相比较明显增高（P 0.05） 。C，D 组的型胶原 mRNA 和 A 组比较明显减少（P 0.05） 。C，D，B 3 组之间比较无统计学意义（均*P0.05） ，结果见表 1。表 1 各组大鼠型胶原 mRNA，TGF-1mRNA和 Smad4 mRNA 比较(略)2.3 各组大鼠肺组织 TGF-1 表达量比较 A 组大鼠 TGF-1 蛋白较 B 组明显增高（P0.05） ，C，D 组的TGF-1 和 A 组比较明显减少（P0.05） ，而 C，D，B 三组之间比较无统计学意义（P0.05） ，
27、见表 1。A 组大鼠 TGF-1mRNA 较 B 组明显增高（P0.05） ，C，D 组的 TGF-1mRNA 和 A 组比较明显减少（P0.05） ，而 C，D，B 3 组之间比较无统计学意义（P0.05） 。结果见表 2。表 2 各组大鼠型胶原蛋白和 TGF-1IOD 值的比较(略)2.4 各组大鼠肺组织 Smad4 mRNA 比较 原位杂交染色可见，A 组肺组织肺泡壁明显增厚，在增厚的肺泡壁及血管周围可见明显 Smad4 mRNA 表达，呈局灶性。C、D 组肺组织炎症及损伤明显减轻，不均匀增厚的肺泡间隔可见散在 Smad4 mRNA 表达；B 组肺组织形态正常，可见少许散在炎性区，Smad4 mRNA 表达不明显。但各组大鼠肺组织 Smad4 mRNA 组间均没有明显差别（P0.05） 。3 讨论肺纤维化是肺组织对各种原因所致肺损伤的创伤愈合反应。肺受
