1、超细珠黄凝胶质量标准研究【摘要】 目的 建立超细珠黄凝胶的质量标准。方法 采用薄层色谱法鉴别靛玉红、胆酸、龙脑；采用高效液相色谱法测定制剂中靛玉红和胆酸的含量。结果 薄层斑点清晰,重现性好。含量测定靛玉红平均回收率为 100.3%,RSD2.1%；胆酸平均回收率为 98.9%,RSD1.8%。结论 方法简便、准确,可用于超细珠黄凝胶的质量控制。 【关键词】 超细珠黄凝胶；薄层色谱法；高效液相色谱法；靛玉红；胆酸Abstract：Objective To establish the quality standard for Ulter Zhuhuang gel. Methods Indirubi
2、n, cholic acid and borneol were identified by TLC. The content of indirubin and cholic acid was determined by HPLC. Result The TLC sports developed was fairly clear. The HPLC method showed that the average recovery of indirubin and cholic acid was 100.3% with RSD2.1% and 98.9% with RSD1.8% respectiv
3、ely. Conclusion The method is convenient and accurate. It can be used for the quality control of Ulter Zhuhuang gel.Key words： Ulter Zhuhuang gel；TLC；HPLC；indirubin；cholic acid超细珠黄凝胶是以珠黄散为基本方,应用超细粉体等技术研制的一种新型制剂(专利号 ZL 03152990.9),内含珍珠、牛黄、青黛、冰片等,具有清热解毒、去腐生肌之功能。为了控制该制剂的质量,确保临床疗效,我们采用薄层色谱法对处方中青黛、牛黄、冰片等
4、药材的主要成分靛玉红、胆酸、龙脑进行了定性鉴别；并用高效液相色谱法对凝胶中靛玉红和胆酸含量进行测定。1 仪器与试药美国 Waters 高效液相色谱仪；Waters 486 紫外检测器；Alltech 500 型蒸发光散射检测器；Waters 515 泵；WDL-95 色谱工作站(大连物理化学研究所)；FA1104 电子天平(上海)；KQ-250B 型超声波清洗器(昆山)。靛玉红(批号 0717-200003)、胆酸(批号 10078-0013)、龙脑(批号881-200001)对照品由中国药品生物制品检定所提供；药材由南京市同仁堂药业有限责任公司提供；超细珠黄凝胶及空白凝胶自制。甲醇为色谱纯；
5、其它试剂均为分析纯。2 薄层色谱鉴别2.1 溶液的制备2.1.1 靛玉红、胆酸、龙脑对照品液的制备 分别称取干燥至恒重的靛玉红、胆酸、龙脑对照品 2 mg,加氯仿适量溶解于 2 mL 量瓶中,定容至刻度。2.1.2 青黛、牛黄、冰片对照药材液的制备 分别称取青黛、牛黄、冰片 0.5 g,加入氯仿 20 mL,超声提取 0.5 h,滤过,上清液置水浴蒸干,残渣加氯仿溶解,转移至 2 mL 量瓶,定容至刻度。2.1.3 凝胶样品供试液的制备 称取超细珠黄凝胶 5 g,加入氯仿 20 mL,超声提取 0.5 h,滤过,上清液置水浴蒸干,残渣加氯仿溶解,转移至 2 mL 量瓶中,定容至刻度。2.1.4
6、 空白凝胶供试液的制备分别取不含青黛、牛黄、冰片的阴性凝胶样品,按“2.1.3”项下方法制备相应空白供试液。2.2 靛玉红的薄层色谱鉴别分别吸取靛玉红对照品液、青黛药材对照液、样品供试液、缺青黛的空白凝胶供试液,分别点于同一薄层硅胶 G 板上,以苯-氯仿-丙酮(541)为展开剂1上行展开,展距约 15 cm,取出,晾干,可见光下检视。供试品色谱中,在与对照品和对照药材色谱相应的位置显相同颜色斑点,而空白凝胶供试液无干扰。2.3 胆酸的薄层色谱鉴别分别吸取胆酸对照品液、牛黄药材对照液、样品供试液、缺牛黄的空白凝胶供试液,分别点于同一薄层硅胶 G 板上,用异辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸(1575)作为展
7、开剂1,展开,取出晾干,喷以 10%硫酸乙醇液,105 加热至斑点显色清晰,放冷,在 365 nm 紫外灯下观察。供试品色谱中含有与胆酸标准品及牛黄药材对照液一致的荧光斑点,而空白凝胶供试液无干扰。2.4 龙脑的薄层色谱鉴别分别吸取龙脑对照品液、冰片药材对照液、样品供试液、缺冰片的空白凝胶供试液,分别点于同一薄层硅胶 G 板上,以石油醚-乙酸乙酯-苯(1824)作为展开剂2,展开,取出,晾干,喷以 10%香草醛浓硫酸溶液,于 105 加热至斑点显色清晰。供试品色谱中含有与龙脑标准品及冰片药材对照液一致的斑点,而空白凝胶供试液无干扰。3 含量测定3.1 靛玉红的含量测定3.1.1 色谱条件 Li
8、chrospher RP C18 色谱柱(汉邦科技)；流动相：甲醇-水-甲酸(80201)；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ；AUFS：0.5；进样量：5 L。在此条件下取靛玉红对照品液、凝胶样品供试液、缺青黛的空白凝胶样品供试液分别进样,结果显示,靛玉红峰对应处无干扰峰存在。见图 1。3.1.2 线性关系考察 精密称取靛玉红对照品 1.3 mg,定容于 50 mL 量瓶中,加适量甲醇超声使其充分溶解,定容,得浓度为 26.0 g/mL 的靛玉红标准液。分别精密量取靛玉红标准液 0.5、1、2、5 mL 置 10 mL 量瓶中,用甲醇稀释并定容至刻度,分别得浓度
9、为 1.3、2.6、5.2、13 g/mL 对照品液。上述对照品液和原标准液依次进样,以对照品浓度为横坐标,峰面积积分值为纵坐标,绘制标准曲线。靛玉红浓度在 1.326.0 g/mL 范围内呈线性关系。回归方程：Y8 700.924 420.0X,r0.999 8。3.1.3 样品供试液的制备 精密称取凝胶样品 2.0 g,置三角烧瓶中,分次加入氯仿20、20、10 mL,各超声提取 30 min,合并氯仿提取液,水浴挥干,残渣加甲醇溶解并定容至 1 mL,用微孔滤膜(0.45 m)滤过,取续滤液供测定用。3.1.4 精密度试验 精密吸取对照品液,重复进样,记录峰面积。结果 6 次进样峰面积的
10、 RSD1.29%。3.1.5 重复性试验 精密吸取同一批样品供试液,重复进样。结果 6 次进样峰面积的RSD1.76%。3.1.6 稳定性试验 取对照品液,在 0、l、2、3、4、5 h 分别进样,记录峰面积,结果6 次进样峰面积的 RSD1.03%,可见 5 h 内测定结果稳定。3.1.7 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批样品 6 份,每份 2.0 g,分别精密加入定量的靛玉红对照品液,按“3.1.3”项处理后测定其中靛玉红含量。结果平均加样回收率为 100.3%,RSD2.1%,见表 1。表 1 靛玉红加样回收率试验结果(略)3.1.8 样品含量测定取 3 批超细珠黄凝胶样品(0
11、30107, 030118,030125),按“3.1.3”项处理,测定靛玉红含量。3 批凝胶中靛玉红含量分别为3.313、3.034、3.469 g/g,平均含量为 3.272 g/g。3.2 胆酸的含量测定3.2.1 色谱条件3 Lichrospher RP C18 色谱柱(汉邦科技)；流动相：甲醇-水-冰醋酸(80200.01)；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ；蒸发光散射检测器参数：漂移管温度 105 ,雾化气体(N2)流速：2.05 SLPM；进样量：5 L。在此条件下取胆酸对照品液,凝胶样品供试液,缺牛黄的空白凝胶样品供试液分别进样,结果显示,空白凝胶样品在胆酸峰对应处无干
12、扰,见图2。3.2.2 线性关系的考察 精密称取胆酸对照品 45.10 mg,于 50 mL 量瓶中,加适量甲醇超声使其充分溶解,定容,得浓度为 902.0 g/mL 的胆酸标准液。分别精密量取上述标准液 1、2、4、6、8 mL 置 10 mL 量瓶中,用甲醇定容,得浓度为90.2、180.4、360.8、541.2、721.6 g/mL 的对照液。依次进样,以对照品浓度的自然对数 lnX 为横坐标,峰面积的自然对数 lnY 为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程为：lnY4.146 21.509 1 lnX, r0.999 9。可见,样品浓度在 90.2902.0 g/mL 范围内线性关系良好
13、。3.2.3 样品供试液的制备 精密称取超细珠黄凝胶 2.0 g,置三角烧瓶中,分次加入甲醇20、20、10 mL,各超声提取 30 min,合并甲醇提取液,水浴挥干,残渣加甲醇溶解并定容于 5 mL 量瓶,用微孔滤膜(0.45 m)滤过,取续滤液供测定用。3.2.4 精密度试验 精密吸取胆酸对照溶液,重复进样,记录峰面积。结果 6 次进样峰面积的 RSD1.72%。3.2.5 重复性试验 精密吸取样品供试溶液,重复进样,结果 6 次进样峰面积的RSD1.17%。3.2.6 稳定性试验 取胆酸对照溶液,在 0、2、4、6、8、10 h 分别进样 5 L,记录峰面积,结果 6 次进样峰面积的 R
14、SD2.52%,可见在 10 h 内测定结果稳定。3.2.7 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批样品 6 份,每份 2.0 g,分别精密加入定量的胆酸对照品液,按“3.2.3”项处理后测定其中胆酸含量。结果平均加样回收率为 98.9%, RSD1.8%,见表 2。表 2 胆酸加样回收率试验结果(略)3.2.8 样品含量测定 取 3 批超细珠黄凝胶样品(030107, 030118,030125),按“3.2.3”项处理,测定胆酸含量。结果显示,3 批超细珠黄凝胶样品中胆酸含量分别为 501.8、494.4、508.4 g/g,平均含量为 501.5 g/g。4 讨论青黛中主要含靛玉红、靛
15、蓝、色氨酮、青黛酮等成分,药理研究表明,青黛中的靛玉红具有抗肿瘤活性,还能治疗慢性粒细胞白血病等病症。而中华人民共和国药典1中对青黛中靛玉红仅有定性检查。为了更好地控制超细珠黄凝胶中青黛的质量,我们建立了靛玉红的高效液相色谱分析方法,操作简单,结果准确,可以有效地检测青黛中的靛玉红含量。牛黄为牛科动物黄牛或水牛的胆囊结石,主要含胆汁酸、胆红素、胆固醇、麦角固醇、多种氨基酸等成分。胆酸是胆汁酸中一种游离型甾体化合物,也是牛黄的主要指标性成分之一。由于胆酸结构中不含生色基团,因此,使用高效液相色谱常用检测器(如紫外、荧光检测器)测定其含量时,需在短波末端(210 nm)进行,灵敏度低,而且一些微量
16、强吸收杂质和溶剂会产生干扰,影响色谱峰分离。蒸发光散射检测器(evaporative light-scattering detector,ELSD)是一种新型质量检测器,其测定原理是基于不挥发样品分子对光的散射程度与其质量成正比,与其所含基团性质无关,主要用于没有紫外或为紫外末端弱吸收的样品。我们采用 ELSD-HPLC 联用测定超细珠黄凝胶中胆酸含量,结果准确,重现性好,利于其中牛黄的质量控制。【参考文献】1 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)S.北京：化学工业出版社,2005.138,48,附录 12.2 刘汉清,袁红宇,许金宏,等.宫糜药膜与宫糜散质量对比研究J.江苏药学与临床研究,1996,4(2)：1015.3 冯 芳,马永建,陈 明,等.反相高效液相色谱-蒸发光散射检测法同时测定人工牛黄中多组分含量J.药学学报,2000,35(3)：216219.
