1、持续动态压应力下骨折愈合时环氧化酶及相关信号分子的表达作者：任可 张春才 汪光晔 赵建宁 陆维举 李波 【摘要】 目的：探讨持续动态压应力环境对实验性骨折愈合时环氧化酶 mRNA 表达水平以及前列腺素 E2 (PGE2)和环磷酸腺苷(cAMP)含量的影响. 方法：80 只新西兰兔行单侧肱骨干横断截骨，实验组以天鹅记忆接骨器内固定，在骨折端造成持续动态压应力，对照组以 4 孔加压钢板固定. 分别于术后第 3， 7， 14， 21， 28， 56， 84 日时，在骨折间隙内取材，行组织学、放射免疫和 Realtime RTPCR 等观察及检测. 结果：环氧化酶2(COX2) mRNA 的表达量以及
2、 PGE2 和 cAMP 的含量均较骨折前显著上升，且实验组在术后 34 wk 时以上指标明显高于对照组，组织学结果则显示实验组骨折间隙内软骨内成骨和编织骨向板层骨的改建均领先于对照组. 结论：天鹅记忆接骨器产生的持续动态压应力通过 COX2 ，PGE2 和 cAMP 这一信号通路使得成骨细胞分化成熟，促进了骨折愈合. 【关键词】 骨折内固定术； 骨折愈合； 应力； 环氧化酶； 前列腺素 E2； 形状记忆合金 【Abstract】 AIM: To explore the effect of continuous dynamic pressure stress on cyclooxygenase
3、(COX) mRNA expression and prostaglandin E2 (PGE2) and cAMP contents during experimental fracture healing. METHODS: Unilateral osteotomy of left humeral diaphysis was performed in 80 adult New Zealand rabbits. The humeral fracture was fixed with swanlike memory connector (SMC) in study group and with
4、 4hole dynamic compression plate (DCP) in control group. Samples from the fracture gaps were obtained at 3, 7, 14, 21, 28, 56 and 84 days after operation. The temporal expression patterns of COX mRNA during the repair process were examined through realtime RTPCR. The contents of PGE2 and cAMP were d
5、etected through radioimmunity method and the process and quality of fracture healing were observed histologically. RESULTS: The relative levels of COX2 mRNA as well as the contents of PGE2 and cAMP were elevated after fracture, and were significantly higher in study group than those in control group
6、 at 3 and 4 weeks postoperatively. Histological observation revealed that the mineralization of cartilage matrix, the endochondral bone formation and the callus remodelling took place earlier in study group. CONCLUSION: The persistent dynamic longitudinal pressure stress produced by SMC may contribu
7、te to endochondral bone formation of callus and accelerate fracture healing, which is considered to be closely related with the signaling pathway that has several critical components including COX2, PGE2 and cAMP. 【Keywords】 internal fixation; fracture healing; stress; cyclooxygenase; prostaglandin
8、E2; shape memory alloy 0 引言 骨折愈合是复杂的病理生理过程，并受到生物力学环境的调控. 我们利用镍钛合金的形状记忆效应，根据临床使用的人体肱骨干天鹅型记忆接骨器按比例缩小制成了兔肱骨干的形状记忆接骨器（shape memory connector，SMC）. 该器械的材料性能和几何构型可以保证骨折处的稳定，并在骨折端产生持续动态的压应力1. 这与其他内固定物的力学环境明显不同，临床应用显示骨折愈合速度快，成功率高. 本实验考察了兔肱骨干骨折间隙内环氧化酶1(cyclooxygenase1, COX1) 、环氧化酶2(cyclooxygenase2, COX2) mRN
9、A 的表达情况以及前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)和环磷酸腺苷 (cyclic adenosine monophosphate, cAMP)含量与愈合进程的关系，旨在探讨持续动态压力环境对骨折愈合的影响及可能的机制. 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 SMC 的制作 取含镍 50%53%的镍钛合金板材，厚 1.5 mm，依据兔肱骨干中段解剖特征，制成由体部、尾钩、轴向加压支和持骨部组成的 SMC. 体部近端宽 8 mm，远端宽 6 mm，持骨部远、近端内径分别为 5 mm 和 7 mm，内固定器的长度 30 mm. 热处理取向单程，形状恢复温度（332）.
10、将 SMC 置于 0 4的冰水中降温塑变，持针器展开持骨部，展距略大于骨骼直径. 向背侧拉展加压钩，暂架于体部背侧，复位骨折端并将体部中点对准骨折处，比拟尾钩在近折段处的位置钻孔，置入 SMC，再依伸展后的加压钩所在皮质骨处钻孔并插入加压钩, 用 4050温水复温完成固定1-2. 1.1.2 兔肱骨干骨折 4 孔加压钢板的制作兔肱骨干骨折 4 孔加压接骨板(dynamic compression plate, DCP)及配套螺钉由上海浦卫医疗器械公司制造. 其材料为 316 L 不锈钢，长、宽、厚分别为 38，4 和 1.6 mm. 1.1.3 试剂 DRR041S Realtime PCR
11、试剂盒和 DRR019A RTPCR 试剂盒(TaKaRa公司)；LightCycler实时定量 PCR 扩增仪（Roche 公司产品） ；兔COX1 ，COX2 和 5 磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehydes phosphatedehydrogenase, GAPDH)的引物由北京奥科公司合成，序列如下：COX1 ：5 GGC TCG CAG GAG TAC AGC TAC 3 ， 5 AGG ACG TGG TGG TCA ATG TTC 3 ；COX2 ：5 TCC CTC ATC TGC AAC AAT GTG 3 ， 5 GCA GGA CTG TGG GAT TGA TG
12、T 3 ；GAPDH ：5 CAC CCA CTC CTC TAC CTT CG 3 ， 5 CGT CCT CCT CTG GTG CTC T 3. PGE2 放射免疫分析试剂盒（苏州大学血液研究所产品） ；cAMP 放射免疫分析试剂盒（上海中医药大学核医学中心提供）. 1.2 方法 1.2.1 手术操作 成年雄性新西兰兔 80 只，体质量(2.40.3) kg. 25 g/L 硫喷妥钠（25 mg/kg）耳缘静脉注射诱导后， 400 g/L 氯安合剂（氯胺酮/安定 2 mL/kg）腹腔麻醉. 俯卧位消毒铺巾，经外侧切口暴露左侧肱骨干中部，线锯横形截骨. 随机分为实验组和对照组，每组 35
13、只. 实验组以 SMC 内固定，对照组以 DCP 内固定. 止血、冲洗后关闭切口. 术后分笼饲养，自由活动，并肌注青霉素钠 20 万 U/d，共 5 d（图 1）. 术后第3，7，14，21，28，56 和 84 日时，每组各处死 5 只兔，取骨折断端间隙内的骨痂组织留作标本，注意防止 RNA 酶污染. 另外，两组分别再取 5只兔，未经截骨手术即予处死，取其肱骨干中段骨质留作空白对照标本.A: 对照组; B: 实验组. 1.2.2 组织学观察 术后 784 d 的标本以 40 g/L 多聚甲醛溶液固定，40 g/L EDTA2Na 溶液脱钙，乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后连续切片，HE
14、染色，在 Olympus BH2 光学显微镜下作光镜观察. 1.2.3 Realtime RTPCR 分析 术后 356 d 的标本约每只动物各取 50 mg，加入液氮迅速研磨至粉末状，再加入 2 mL Trizol，氯仿分离，水相层经异丙醇沉淀，RNA 产物溶解于 20 L DEPC 处理的双蒸水中 . 取总 RNA 1 g，按 DRR019A 试剂盒说明配制成反转录反应液 10 L，65水浴 1 min，30放置 5 min，65孵育 15 min，98灭活逆转录酶 5 min，低温保存. 配制 PCR反应液：20 L，内含 SYBR Premix Ex Taq (2) 10 L，上、下游
15、Primer (10 mol/L)各 0.5 L， RNase Free dH2O 8 L. 分别取 1 L 反转录产物加入含三种引物的 PCR 反应液中，按以下条件反应：95预变性 3 min； 95 2 s，56 8 s，72 1 s 扩增，循环 40 次；绘制熔解曲线. 以双 Ct 值法计算两组各时间点 COX1 和 COX2 cDNA模板数与 GAPDH 的相对值对于骨折前的变化趋势. 1.2.4 PGE2 和 cAMP 含量的测定 电子天平称取 100 mg 骨痂标本，加入生理盐水 3 mL，电动匀浆，收集上清液，在 计数器中测量 PGE2 的放射性强度. 精确称取 50 mg 骨痂
16、标本， 置入醋酸缓冲液中，电动匀浆，上清吹干后按比例稀释，测定cAMP 的放射性强度. 根据标准曲线并计算样本的 PGE2 和 cAMP 含量. 统计学处理：计量数据以 xs 表示，采用 SPSS 11.5 统计软件进行分析，组别和愈合时间的主效应和交互作用以双因素方差分析考察，相同时间点的组间差异行成组 t 检验. 设定检验水准为 0.05. 2 结果 2.1 组织学观察术后 7 d 时，两组骨折间隙内均为纤维肉芽组织结构. 14 d 时两组骨折间隙内软骨痂均基本形成，软骨基质呈淡蓝色. 相比之下，实验组除软骨痂结构外还在部分区域出现了软骨内骨化现象，骨化前沿的软骨基质发生钙化. 21 d
17、时，实验组已初步形成典型的编织骨结构，骨小梁呈针状或薄片状，小梁中央为偏蓝的钙化软骨基质，周围部分为偏红色的骨组织（图 2A）. 而对照组骨折间隙内虽已开始软骨内骨化，但仍有部分区域处于成熟的软骨痂阶段（图 2B）. 术后 28 d 时，两组骨折间隙内均已形成编织骨痂结构，可见很多排列不规则的骨小梁，小梁表面分布着较多成骨细胞. 相对而言，对照组残留的软骨成分更多些，实验组骨小梁中央部位已无蓝染的钙化软骨基质结构. 56 d 时，两组骨折端间均为完全的骨性结构，实验组基本成为板层骨结构，骨板沿骨纵轴方向整齐排列，并可见哈佛氏管结构（图 3A）. 而对照组板层骨排列的方向性较差，细胞数量也较多（
18、图 3B）. 术后 84 d 时，两组骨折间隙内均完全呈板层骨结构，但对照组骨基质方向仍稍显杂乱. 2.2 Realtime RTPCR 结果愈合过程中， 实验组和对照组以及各时间点之间 COX1 mRNA 相对表达量均无统计学意义. COX2 mRNA 的相对表达量均有统计学意义， 但组别与愈合时间之间无明显交互作用. 术后 3 及 4 wk 时实验组 COX2 mRNA 的表达量明显高于对照组， 差异具有统计学意义(P0.05， 表 1)表 1COX1 mRNA, COX2 mRNA 相对表达量(略) 2.3 PGE2 和 cAMP 含量的测定结果显示，两组 PGE2 的含量随骨折的愈合明
19、显增高，且均在 3 wk 时达到高峰，然后下降. 除骨折后 2 wk 时外，PGE2 的含量均明显高于骨折前. cAMP 含量约在 34 wk 时达到高峰，实验组 cAMP 含量明显高于对照组，差异具有统计学意义(P0.05,表 2).3 讨论 环氧化酶(cyclooxygenase，COX)包括 COX1 和 COX2 两种同工酶3. 一般情况下 COX1 的表达量保持稳定，而 COX2 的表达则需多种生理刺激的诱导. COX1-/- 小鼠的骨折愈合过程与野生型小鼠没有显著差异，而 COX2-/- 小鼠骨折处间充质细胞滞留，软骨痂基质钙化延迟，骨折愈合受阻4 ，提示 COX 酶中实为 COX
20、2 对骨折愈合起着不可或缺的作用5-6. 其机理在于 COX2 合成的 PGE2 在骨代谢中的重要作用4 ，后者作为信号分子促使间充质干细胞募集、增殖并分化，导致了骨折处的软骨内成骨和膜内成骨7. 体外实验证实，PGE2 可通过刺激EP2 和 EP4 受体促进 MC3T3E1 等成骨细胞系的增殖成熟，表现为细胞内cAMP 显著增多，然后是 ALP 活性和 I 型胶原的合成上升. 因此目前多认为 PGE2 的成骨作用与第二信使 cAMP 水平升高密切相关8.表 2 两组骨折标本 PGE2, cAMP 放免测量值(略) 研究显示，信号分子 PGE2 和 cAMP 调控骨折愈合的行为受到应力环境的显
21、著影响9 ，一定程度的应变可以促进成骨细胞的增殖分化，同时伴随 PGE2 含量增加及细胞内 cAMP 和 DNA 合成增多. 同样，施加机械负载后成骨细胞内 COX2 的合成也很快增多10. 为此，我们以 SMC和 DCP 在兔肱骨干骨折端制造了不同的应力环境. SMC 的体部和持骨部的多点固定保证了愈合骨折端的稳定，加压钩则在骨折端产生持续的纵向压应力，且镍钛合金弹性模量仅为 54.18 Gpa，无明显应力遮挡效应，肢体活动时骨端承受的压应力进一步增加，因此骨折间隙始终处在持续、动态的压应力/应变下1. 对照组 DCP 的抗剪、抗旋及抗弯作用很好，骨折端早期非常稳定. 但由于骨折端的吸收和骨
22、组织本身的粘弹性等原因，一段时间后 DCP 的加压作用会明显消减，而外加载荷大部分经高刚度的不锈钢内固定物承担，骨折端处于应力遮挡状态，骨折间隙内纵向应变很低. 我们发现两组骨折间隙内的 COX1 mRNA 的表达量相对于骨折前无明显变化，且未表现出时相性规律，相同时间点的组间对比也无显著差异，提示 COX1 在骨折愈合中未发挥明显作用而且其表达量与力学环境无关. 相反，两组术后 COX2 mRNA 的表达量均较骨折前明显上升，且均在 3 wk 时达到高峰，时相性规律明显，说明 COX2 在该骨折愈合模型中发挥重要作用. 又因术后 34 wk 时实验组 COX2 mRNA 的表达量明显高于对照
23、组，我们推测 SMC 的应力场可以提高 COX2 基因的转录水平. 同样，两组 PGE2 和 cAMP 均表现出明显的先升高再下降的趋势且总体上 cAMP 高峰略迟于 PGE2，提示 PGE2 和 cAMP 也与愈合过程密切相关，且 cAMP 作为 PGE2 的第二信使介导成骨细胞的生理反应8,11. 骨折后 34 wk 时实验组 PGE2 和 cAMP 的含量明显高于对照组，提示 SMC 的应力场诱导的 COX2 mRNA 高表达引起了 PGE2 和 cAMP 合成增多. 国外学者在标准的“解剖复位、坚强固定”的动物骨折模型中发现，全部病理切片中真正表现为一期愈合者最多仅占百分之几，所以一期
24、愈合并非普遍现象. 本实验两组骨折间隙内均为二期愈合过程，原因可能是 SMC 材质较低的弹性模量和 DCP 加压作用的减退导致了骨折端一定程度的微动. 相比之下，术后 24 wk 时实验组软骨内成骨和编织骨的形成较对照组提前，8 wk 后实验组的板层骨结构也较成熟. 说明 SMC 的持续动态压应力环境下骨折愈合时软骨基质的钙化、软骨内成骨和编织骨的形成提前，且愈合进程一直领先到板层骨塑形阶段. Brighton 等12的研究也发现，骨折间隙内的纵向压应力可以驱动软骨基质的矿化和间充质细胞向成骨方向的分化，刺激成骨细胞的功能，并促进骨痂改建. 考虑到本实验中两组的差异主要在于内固定生物力学环境，
25、且COX2 mRNA，PGE2 和 cAMP 的升高恰在骨折端发生软骨内成骨时，我们认为 SMC 的持续动态压应力诱导了 COX2 mRNA 的转录， 催化了 PGE2的合成， 这些 PGE2 再作用于特定的受体引起细胞内 cAMP 增多， 然后经 PKA 等途径导致了一系列靶基因的转录和表达， 使得成骨细胞迅速分化成熟并提高了细胞的成骨活性， 促进了软骨痂骨化， 加速了骨折愈合. 【参考文献】 1许硕贵, 张春才, 苏佳灿, 等. 天鹅记忆接骨器治疗肱骨骨折和骨不连的三维有限元分析J. 第二军医大学学报, 2001, 22(10): 943-945. 2张春才, 许硕贵, 王家林, 等. 上
26、肢骨干天鹅型记忆接骨器的设计和临床应用J. 第二军医大学学报, 2001, 22(10): 939-942. 3Einhorn TA. Cox2: Where are we in 2003? - The role of cyclooxygenase2 in bone repairJ. Arthritis Res Ther, 2003, 5(1): 5-7. 4Zhang X, Schwarz EM, Young DA, et al. Cyclooxygenase2 regulates mesenchymal cell differentiation into the osteoblast lineage and is critically involved in bone repairJ. J Clin Invest, 2002, 109(11): 1405-1415. 5Seidenberg AB, An YH. Is there an inhibitory effect of COX2 inhibitors on bone healingJ? Pharmacol Res, 2004, 50(2): 151-156.
