1、赤小豆总黄酮分光光度分析方法建立及全国不同产地药材含量测定作者：卫莹芳，闫婕，王化东，郭山山【摘要】 目的建立一种测定赤小豆中总黄酮含量的方法，为赤小豆的质量控制提供科学依据。方法以芦丁为对照品，亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定赤小豆总黄酮含量。结果线性方程为 A=11.402C-0.004 9，相关系数 r=0.999 9，平均加样回收率为 100.55%，RSD 为 1.36%(n=6)。对全国11 个省的 37 个不同产地的药材中总黄酮含量进行了测定，赤豆含量为0.76%1.31%，赤小豆含量为 0.84%1. 30%。结论该测定方法准确，重复性好，可用于赤小豆药材中总黄酮的含量测定。 【关键
2、词】 赤小豆; 赤豆; 总黄酮; 芦丁; 分光光度法Abstract：ObjectiveTo develop a UV-VIS analysis method for the determination of total flavonoids in adzuki bean，in order to provide a scientific basis for the quality control of adzuki bean. MethodsWith rutin as standard sample, sodium nitrite - aluminum nitrate colorimetric
3、 method was used to determine the content of total flavonoids in adzuki bean.ResultsThe calibration curve of rutin was A=11.402C-0.004 9, r=0.999 9, and the average recovery was 100.55%,with RSD of 1.36%(n=6). The content range of total flavonoids in Phaseolus angularis was from 0.76% to 1.31%, and
4、content range in P. calcaratus was from 0.84% to 1.30%.ConclusionThis detemination method is practical，reproducible and can be used for evaluating the quality of adzuki bean.Key words： Adzuki bean; Total flavonoids; Rutin; UV-VIS spectrophotometry赤小豆为豆科植物赤小豆 Vigna umbeuata Ohwi et Ohashi 或赤豆 Vigna a
5、ngularis Ohwi et Ohashi 的干燥成熟种子，具有利水消肿，解毒排脓的功能1。赤小豆既是常用中药，又是我国广泛食用的豆类。中国的赤小豆资源极其丰富，是产量最多，出口量最大的国家。赤小豆始载于神农本草经 ，列为中品，其后历代本草、医方亦多有记载。现代药理研究表明，赤小豆具有抗氧化、增强免疫、抗菌、雌激素样作用等药理作用，广泛应用于临床治疗急性肾炎、肝硬化腹水、水痘、腮腺炎、炎性外痔、皮肤病等2。在中药材安全性被日益关注的今天，其药食同源的优点使其备受青睐。赤小豆主要含有五环三萜皂苷类、黄酮类、鞣质等化合物。其黄酮类化合物具有较强的体外抗氧化作用，对 Fe2+导致的大鼠原代肝细胞
6、氧化损伤具有保护作用，是预防和治疗肿瘤、肝病等疾病的有效成分3。 中国药典现行版收载赤小豆质量标准极不完善，缺乏内在质量量化指标。本文用亚硝酸钠-硝酸铝显色法建立赤小豆总黄酮含测方法，并对全国 11 省 37 个产地的赤豆、赤小豆总黄酮含量进行了测定，为完善制定赤小豆质量标准奠定基础。1 仪器与材料1.1 材料赤豆药材 29 份，赤小豆药材 8 份，由成都中医药大学闫婕、郭山山、王化东等自采或购于全国 11 个省区，经成都中医药大学卫莹芳教授鉴定为豆科植物赤豆 Vigna angularis Ohwi et Ohashi 或赤小豆 Vigna umbeuata Ohwi et Ohashi 的
7、干燥成熟种子。1.2 仪器 UV-1100 紫外-可见分光光度仪(上海天美科学仪器有限公司)，DZKW-4 电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)，KQ-3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BP121S 电子天平(万分之一 Startorius 德国赛多利斯股份公司)，BP211D 电子天平(十万分之一 Startorius 德国赛多利斯股份公司)。1.3 试药芦丁对照品(批号：100080-200707，购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用);其他试剂均为市售分析纯。2 方法与结果2.1 显色方法及测定波长的选择精密吸取芦丁对照品溶液和供试品溶液适量，用亚硝酸钠-硝酸
8、铝显色法进行显色，以空白试剂为对照，于 200800 nm 波长范围内进行扫描，在 500nm 处有最大吸收，故选 500 nm 为测定波长。见图 1。2.2 对照品溶液的配制取在 120干燥至恒重的芦丁对照品 25 mg，精密称定，置 50 ml 量瓶中，加 70%乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加 70%乙醇至刻度，摇匀。精密量取 20 ml，置 50 ml 量瓶中，加 70%乙醇至刻度，摇匀，即得每毫升中含无水芦丁 0.2 mg 的芦丁对照品标准溶液。2.3 标准曲线的绘制精密量取对照品溶液 1，2，3，4，5，6 ml，分别置 25 ml 量瓶中，各加水至 6 ml，加 5%亚硝酸钠溶
9、液 1ml，摇匀，放置 6 min，加 10%硝酸铝溶液 1ml，摇匀，放置 6 min，加氢氧化钠试液 10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置 15 min，以相应试剂为空白，在500 nm 波长处测定吸光度。以吸光度 A 为纵坐标，浓度 C(mg/ml)为横坐标，绘制标准曲线。得到回归方程为 A=11.402C-0.004 9，r=0.999 9，芦丁在 0.008 1840.049 104 mg/ml 浓度范围内，吸光度与浓度呈良好线性关系。见图 2。图 1 赤豆最大吸收波长光谱图图 2 芦丁标准溶液标准曲线2.4 精密度实验精密吸取芦丁对照品溶液适量于具塞试管中，平行 6 份，按照“2.
10、3”项下方法显色测定吸光度。测定结果的 RSD 为 0.98%，仪器的精密度较好。2.5 稳定性实验精密吸取芦丁对照品溶液适量于具塞试管中，按照“2.3”项下方法显色，显色后放置 5，10，15，30，45，60，90，120 min 后，吸光度分别为0.487，0.486，0.484，0.483，0.480，0.479，0.475，0.472。结果表明该显色反应在 5120 min 内较稳定。2.6 重复性实验取同一批赤小豆样品约 1.0 g，平行 6 份，精密称定，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。6 次重复试验的测定结果平均值为 0.630，RSD 为 1.39%，该方法有较好的重复
11、性。2.7 加样回收率实验精密称取芦丁对照品 25.03 mg，用 70%乙醇定容于 50 ml 量瓶中备用。称取已知含量的赤豆粉末 0.5g，平行 6 份，精密称定，精确加入新制备的对照品溶液 5 ml，混匀，加入 70%乙醇 35 ml，水浴回流 1.5 h，滤过，滤液转移置 50 ml 量瓶中，加 70%乙醇至刻度，精密吸取 5 ml 至 25 ml 量瓶中，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。结果见表 1。平均加样回收率为 100.55%，RSD 为 1.36%(n=6)。表1 加样回收率实验结果2.8 供试品溶液制备方法的选择2.8.1 提取溶剂考察取同一赤豆粉末约 1.0g，平行
12、 8 份，精密称定，分别加入 30%乙醇，50%乙醇，60%乙醇，70%乙醇，80%乙醇，水，甲醇，40%甲醇各 25 ml，超声提取 20 min，滤过，精密移取滤液 3 ml，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。结果(见表 2)表明，采用不同提取溶剂，吸光度的差异较大，水和甲醇做溶剂的吸光度极低，50%以下浓度的乙醇难以过滤。2.8.2 溶剂用量考察取同一赤豆粉末约 1 g，平行 4 份，精密称定，各加 8，16，25，50 倍量 70%乙醇，分别超声提取 20 min，滤过，精密移取滤液 5 ml，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。结果表明，溶剂用量对吸光度有较大影响，随着溶剂用量
13、的增加，吸光度也相应增加。见表 3。表 2 提取溶剂的考察结果 表 3 溶剂用量的考察结果2.8.3 提取方法考察取同一赤豆粉末约 1 g，平行 2 份，精密称定，各加 25 ml 70%乙醇，分别以超声、回流提取 30 min，滤过，精密移取滤液 3 ml，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。吸光度分别为0.304，0.611。结果表明，相同条件下，回流提取方法要明显优于超声提取。2.8.4 提取时间考察取同一赤豆粉末约 1 g，平行 4 份，精密称定，各加 25 ml 70%乙醇，分别以 80回流提取 30 min，1，1.5，2 h，滤过，精密移取滤液 3 ml，按照“2.3”项下方法
14、显色测定吸光度。结果(见表4)表明，提取时间为 0.5 h 的吸光度最低。表 4 提取时间的考察结果2.8.5 回流温度取同一赤豆粉末约 1 g，平行 4 份，精密称定，各加 25 ml 70%乙醇，分别在 60，70，80，90水浴温度下回流 1 h，滤过，精密移取滤液 3 ml，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。吸光度分别为 0.521，0.576，0.550，0.530。结果表明，7080为最佳回流温度。2.8.6 pH 值取同一赤豆粉末约 1 g，平行 4 份，精密称定，各加25 ml 70%乙醇，分别调节 pH 值到 6，7，8，9，10，于 80水浴温度下回流 1 h，滤过，精
15、密移取滤液 3 ml，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。吸光度分别为 0.579，0.550，0.571，0.503。结果表明，不同 pH值，对吸光度影响不大。2.8.7 正交实验根据单因素实验的结果，选择乙醇浓度(A)、溶剂量(B)、提取时间(C)为 3 个因素，每个因素选用 3 个水平设计“乙醇回流提取因素水平表” ，见表 5。以用 L9(34)正交表任意安排因素，作 3 次重复实验。取同一赤豆粉末约 1 g，精密称定，置锥形瓶内，按因素水平表及正交设计表进行乙醇回流提取，提取液过滤，滤液转移至 50 ml 容量瓶中，加适当的溶剂至刻度，摇匀，作为供试品储备液。精密量取储备液 5 ml
16、，置 25 ml 容量瓶中，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。采用 SPSS15.0 对试验结果进行正交设计试验分析，以确定最佳提取条件，结果见表 6。表 5 乙醇回流提取因素水平表 6 乙醇回流提取正交设计及试验结果吸光度越大，黄酮的提取率就越高。方差分析表明，乙醇浓度(A)、溶剂量(B)对黄酮提取率有极显著影响(P0.01)，提取时间(C)对黄酮提取率无显著影响(P0.05)。重复试验 P0.05，三次重复实验无显著差异。直观分析 R 值表明，影响赤豆提取率的主次因素分别为 BAC，最佳提取工艺是 A2B3C2，即用 70%的乙醇 35 ml，回流提取 1.5 h。2.9 不同产地赤豆
17、、赤小豆样品中总黄酮的含量测定取各个产地的赤小豆及赤豆药材粉末约 1.0 g，精密称定，置 250 ml 锥形瓶中，加70%乙醇 35 ml，于水浴温度 75回流提取 1.5 h， 放冷，过滤，滤液转移至 5 0ml 量瓶中，加 70%乙醇至刻度，摇匀，作为供试品储备液。精密量取 5 ml 供试品储备液置 25 ml 容量瓶中，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。根据标准曲线计算供试品溶液总黄酮含量。结果见表 7。3 讨论总黄酮是赤小豆抗氧化、预防各种慢性疾病的活性成分。本文建立了亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定赤小豆药材中总黄酮的含量的方法，并研究了赤小豆总黄酮的制备方法，对提取方式、提取溶剂、
18、溶剂用量等进行考察，最终确定提取条件为用 35 倍量的 70%的乙醇，回流提取 1.5 h。方法学研究结果表明，该含量测定方法准确度高、重复性好(RSD 为1.39%)，加样回收率为 100.55%，RSD 为 1.36%。因此本方法可作为赤小豆总黄酮的含量测定方法。表 7 全国不同产地赤豆、赤小豆总黄酮的含量全国 8 省，29 个产地赤豆样品中总黄酮的含量在 0.76%1.31%，陕西省平遥县西善乡的总黄酮含量高于其他地区，达 1.31%，四川省荷花池药材市场购德阳产商品的含量最低，只有 0.76%。全国 5 省，8 个产地的赤小豆样品中总黄酮的含量在 0.84%1.30%，购于清平药材市场
19、的总黄酮含量最高，为 1.30%，贵州省黔东南苗族侗族自治区的含量最低，为0.84%。建议赤小豆药材总黄酮含量不得低于 0.80%。当年自采的样品大多含量较高，商品药材有些含量偏低，是否与商品药材贮藏时间久，虫蛀现象有关，值得深入研究。药用赤小豆的贮藏方法及贮藏年限需要进一步加以规范。【参考文献】1 国家药典委员会.中国药典，部S.北京：中国医药科技出版社，2010：147.2 肖培根.新编中药志(二)M.北京：化学工业出版社， 2001：248.3 李 波，赵青威，Nadine Weber，等.赤豆荚果总黄酮提取物对原代培养大鼠肝细胞氧化损伤的保护作用J.营养学报，2005，27(5)：397.
