1、川乌煎煮时间和给药剂量与毒性的相关性研究【摘要】 目的揭示川乌煎煮时间、给药剂量与毒性的相关性。方法采用均匀设计的方法，将川乌分别煎煮 15 min，30 min，1 ，2 ，3 ，4 ，6 h，生药含量依次为临床用量的 6，12，24，48，72，96，120倍。模型对照组和各给药组于复制痹证动物模型后，按组给药 30 d。观测动物生长发育、血液学、血液生化学、脏器系数、病理组织学变化及停药 15 d 后上述指标的变化。将结果进行多元回归分析，得出川乌煎煮时间、剂量与毒性的相关性。结果川乌水煎液能抑制痹证动物的足跖肿胀；对模型动物的生长发育无明显影响；对其造血系统无明显毒性；对其肝脏、肾脏、
2、心脏有一定毒性。川乌水煎液毒性最大的煎煮时间和给药剂量是 30 min,120 倍。结论煎煮 30 min，给药剂量为临床用量 120 倍时，川乌水煎液对痹证动物产生的毒性最大，但药效最佳。 【关键词】 川乌 煎煮时间 给药剂量 毒性 均匀设计Abstract：ObjectiveTo study the correlation between decocting time (DT),administration dosage(AD) and the toxicity of Radix Aconiti(RA).MethodsAccording to uniform designed techno
3、logy, RA was decocted with different duration of 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours and 6 hours,and the content of RA was 6 times, 12 times, 24 times, 48 times, 72 times, 96 times, 120 times of clinic AD respectively. All rats except normal control group were made up BiZheng a
4、nimal model, and administered RA decocted liquids for 30 days. The changes of hematology, blood biochemistry,organ coefficient, histopathology test index were detected before and after 15 days. The regression analysis was adopted to study the relativity between DT, AD and the toxicity of RA.Results
5、RA decocted liquids could decrease voix pedis tumefaction of BiZheng model animals, but had no effect on the growth and development and hematopoietic system of model animals. They had certain toxicity to livers, kidneys, and hearts of the model animal.The DT and AD of maximal toxicity of RA decocted
6、 liquids were 30 minutes and 120 times.Conclusion RA decocted liquids with DT 30 min and AD 120 times have the maximal toxicity and the best medicinal effect.Key words：Radix Aconiti(RA); Dectocting time (DT); Administration dosage(AD); Toxicity; Uniform Design川乌为毛茛科植物乌头 Aconitum carmichaeli Debx.的干燥
7、母根。始载于神农本草经 ，列为下品。其味苦、辛，大热，有大毒，功能祛风除湿、温经散寒、行淤止痛1 。研究表明川乌具有良好的镇痛、抗炎和免疫抑制作用，但因其毒性大，临床上常因用药不当而造成中毒甚至死亡25 。目前，川乌的毒理学实验研究较少，已报道的川乌长期毒性实验中，均采用正常健康动物6 ，对病证模型动物的毒性研究目前未见。煎煮时间与给药剂量是影响川乌毒性的重要因素。其煎煮时间，临床报道从 15 min6 h 不等，也有以口尝不麻为度；给药剂量，临床应用从 1.560 g 不等。因此实验根据临床实际应用和前期完成的急毒实验情况，设定了 7 个煎煮时间点和给药剂量，并引入均匀设计法，研究不同煎煮时
8、间，给药剂量的川乌水煎液对痹证动物模型的长期毒性的影响。1 材料与仪器1.1 药物川乌，购自四川江油，经成都中医药大学中药鉴定教研室鉴定为毛茛科植物乌头 Aconitum carmichaeli Debx.的干燥母根。参见中国药典2000 年版制剂通则项，以 3 倍量水浸泡 30 min，加至 10倍量水煎煮，煎煮时间分别取煮沸后 15 min，30 min，1 h，2 h，3 h，4 h，6 h 等 7 个时间点，煎煮完毕减压浓缩为每毫升含原生药 1g。根据均匀设计表 U7(74)，川乌煎煮 15 min，30 min，1 h，2 h，3 h，4 h，6 h 7 个时间点分别取临床剂量3g（
9、60 kg）-1d-1的72 倍，12 倍，120 倍，48 倍，6 倍，96 倍和 24 倍。实验时用蒸馏水配制成适当浓度的药液。造模药物为完全弗氏佐剂（美国 Sigma 公司产品） 。1.2 动物SPF 大鼠 180 只，雄性，体重 130160 g，由成都中医药大学实验动物研究中心提供，合格证号：川实动管质 SCXK(川)200412 号。1.3 仪器与试剂电子天平；KX21N 型电子血球自动计数仪（日本 Sysmex 公司） ；TMS1024i 型全自动血液生化分析仪（日本东京贸易株式会社） ；光学显微镜（日本奥林巴斯仪器公司） ，游标卡尺，YT-100 电子压痛仪等。Urea，Cre
10、a，TP，ALB，ALT，AST，ALP 检测试剂盒（上海申能德赛诊断技术有限公司生产，生产批号依次为：310/021/1，171/014/1，231/021/01，022/018/03，4609/23262/01，4704/23872/02，5406/26835/1） ；TC，TG 检测试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司生产，生产批号依次为：200506，200502） ；TBIL，GLU 检测试剂盒（四川美辰生物科技有限公司生产，生产批号依次为：0504，0506） ；TT 检测试剂盒 （ROCHE 公司生产，生产批号 050186） 。1.4 实验设施SPF（specific path
11、ogen free condition）实验动物屏障系统，由成都中医药大学实验动物研究中心提供，使用许可号：第 05-50 号。2 方法2.1 动物分组与造模及给药健康合格的 SPF 大鼠 180 只，全雄，随机分为 9 组，即空白对照组、模型对照组、生川乌 15 min 水煎液组、30 min 水煎液组、1 h 水煎液组、2 h 水煎液组、3 h 水煎液组、4 h 水煎液组和 6 h 水煎液组，每组 20 只。模型对照组和各给药组于大鼠右足足跖处注射完全弗氏佐剂 0.1 ml/只。从造模当天开始，各组每日于 9 11 AM 按大鼠体重 10 mlkg-1d-1 分别灌喂蒸馏水、不同煎煮时间点
12、的生川乌水煎液，共 30 d。2.2 检测指标2.2.1 一般状态观察观察动物造模及给药期间的一般行为活动和精神状况，每周记测 1 次体重；测量大鼠足肿胀度：分别于造模前、造模后 0.5h,18h，第 2 天至第 10 天上午 8 时用游标卡尺法测定各组大鼠右足肿胀度，第 11 天至第 30 天上午 8 时测定各组大鼠左、右足肿胀度。2.2.2 血液学及血生化学检测末次给药 24 h 后，每组随机取 12只大鼠，股静脉采血，作WBC，RBC，Hb，HCT，MCV，MCH，MCHC，PLT，Ret 计数检测，以及GLU，UREA，CREA，TP，ALB，ALT，AST，TBIL，TC，TG 以及
13、电解质Na，K，Cl 离子的测定。2.2.3 系统剖检与脏器系数及组织病理学检测脱颈椎法处死动物，进行系统剖解。称其脏器湿重并计算脏器系数。组织病理学检测：取动物心、肝、脾、肺、肾、脑、甲状腺、胸腺、肾上腺、胰腺、脊髓、食管、气管、胃、小肠、大肠、睾丸、附睾、前列腺组织各一块，立即投入 10%甲醛液内固定，石蜡包埋，切片，HE 染色，光学显微镜下观察。痹证关节病理组织观察：取左、右踝关节，采用 10%中性甲醛溶液固定，24 h 后用混合脱钙液加温脱钙 48 h，常规进行石蜡包埋，切片（5 m） ，HE 染色，光镜下观察。2.3 可逆性观察剩余动物作一般状态观察，每周记测 1 次体重。15 d
14、后处死，进行系统剖检，称取脏器湿重，计算脏器系数，组织病理学检查，血液学及血液生化学检测，指标和方法同前。2.4 统计学方法 数据资料先用 SPSS 统计软件单因素方差分析进行统计学处理，再用均匀设计软件进行多元回归分析。3 结果3.1 川乌水煎液给药 30 d 一般状态观察受试动物用药期间，一般行为活动正常，对刺激反应灵敏，无呆滞、嗜睡，无躁动、震颤，无流涎、流涕，饮水、摄食正常，粪便质地无异常，会阴部无污秽。各组体重无明显差异。 3.2 川乌水煎液给药 30 d 大鼠足跖肿胀度各给药组大鼠右后足（致炎侧）于造模后 18 h 至第 2 天，足跖和踝关节明显红肿，局部皮温增高，肿胀度达到峰值，
15、持续 2 d 后逐渐减轻，第 21 天左右又出现一次肿胀高峰。第 11 天，与空白对照组比较，给药组大鼠左足有明显肿胀。给药期间，各给药组大鼠的左、右足肿胀度较模型组有不同程度的减轻（P0.05 或 P0.01 或 P0.001） 。药效发挥最佳的煎煮时间和给药剂量集中在 30 min,120 倍。部分足肿胀度测定数据见表 12。表 1 川乌水煎液给药 30 天对大鼠右足足跖肿胀度的影响（略）表 2 川乌水煎液给药 30 d 大鼠左足足跖肿胀度的影响（略）表 1 回归分析：第 5 天肿胀度回归方程：Y0.6113.10103X15.42105 X1 X21.86105 X22 1.44107
16、X23(最优条件：煎煮时间 30 min，给药剂量 120 倍)；第13 天肿胀度回归方程：Y0.6131.74103X11.15105 X24.54105 X1X2 8.14X22(最优条件：煎煮时间 30 min，给药剂量 120 倍)；第 21 天肿胀度回归方程：Y0.6322.94104 X1X25.07106 X12X22.91X22 X1(最优条件：煎煮时间 30 min，给药剂量 120 倍)；第 26 天肿胀度回归方程：Y0.5621.21102X19.94104 X22.87104X121.30104 X1X24.90108 X23(最优条件：煎煮时间 30 min，给药剂量
17、 120 倍)；第 30 天肿胀度回归方程：Y0.5961.35103X11.16104 X22.96107 X1X2(最优条件：煎煮时间 30 min，给药剂量 120 倍)。表 2 回归分析：第 13 天左足肿胀度回归方程：Y0.3861.26103X28.98106 X225.18107 X22X1（最优条件：煎煮时间 30 min，给药剂量 120 倍） ；第 17 天肿胀度回归方程：Y0.3668.34104X13.27104 X29.03105X2X11.18106 X22 X11.51108 X23（最优条件：煎煮时间 30 min，给药剂量 120 倍） ；第 27 天肿胀度回
18、归方程：Y0.3251.24103X27.79106 X122.28105 X221.08107 X23（最优条件：煎煮时间 30 min，给药剂量 104.2倍） 。3.3 川乌水煎液给药 30 d 大鼠血液学、血液生化学检测各组大鼠血液学各项指标均在正常范围内。血液生化学指标中，除 2 h 组外的其余各给药组 Crea 值较空白对照组显著增高。对异常指标进行多元回归分析：Crea 值回归方程：Y45.73.45X10.162X28.92102X121.88103X221.09103X12X2。结果显示毒性最大的煎煮时间与给药剂量是 30 min，120倍。部分血液生化学检测数据见表 3。表
19、 3 川乌水煎液给药 30 d 对大鼠血液生化学的影响（略）3.4 川乌水煎液给药 30 d 脏器系数、病理组织学检查 1 h 组肾脏脏器系数明显高于空白对照组，肾脏器系数回归方程Y6.785.1102X11.04102X25.7103X1X27.93105X22X1,结果显示毒性最大的煎煮时间与给药剂量是 30 min，38.15 倍。部分脏器系数检测数据见表 4。表 4 川乌水煎液给药 30 d 对大鼠脏器系数的影响（略）病理组织学检查结果：15 min 组有 1 例心脏局灶性炎症；30 min 组有 1 例肝脂肪样变；15 min 组有 2 例肾脏局灶性炎症。模型组有 7 例踝关节软组织
20、充血、水肿。3.5 生川乌水煎液停药可逆性观察受试动物停药期间，生长发育正常，一般行为和一般状态正常，各组间体重无明显差异。3 h 组 Urea值较空白组有明显升高，Urea 值的回归方程：Y10.50.536X16.91102X21.3102X123.53104X225.11105 X1X22，结果显示毒性最大的时间与剂量是 30 min，120倍。6 h 组肾脏和 15 min 组脑的脏器系数较空白组明显升高。肾脏器系数回归方程：Y7.281.44102X121.64103X1X24.59104X13。脑脏器系数回归方程：Y5.384.65102X12.21102X21.47103X124
21、.04104X222.08106X23。结果显示，毒性最大的煎煮时间与给药剂量分别是 20.55 min，6 倍和 15.85 min，120 倍。病理组织学检查结果显示，各给药组动物的组织器官均为正常，模型组有 4 例踝关节软组织有慢性炎症及纤维组织增生。部分血液生化学指标测定数据见表 5。表 5 生川乌水煎液停药 15 d 对大鼠血液生化学的影响（略）4 讨论当前，药物长期毒性实验的实验动物一般选用健康动物。由于乌头类有毒中药的安全性研究中大量实验已证明，乌头类中药水煎液对疾病模型动物产生的毒性效应与健康动物有差异（杨 卓.附子煎煮时间、给药剂量与毒性的相关性研究.成都中医药大学 2002
22、 级硕士学位论文） 。结合病证动物模型研究川乌的毒性将对临床用药更具指导意义，因此我们选用佐剂性关节炎模型大鼠作为研究川乌长期毒性的实验对象，揭示生川乌水煎液煎煮时间和给药剂量与毒性的相关性。由于影响中药毒性的因素多元化，故本课题引入了数学的方法均匀设计。其特点为每因素的每水平只作一次实验，实验次数等于水平数。应用均匀设计法得出的实验结果与正交设计并无显著性差异，仍能反映体系的主要特征，因此特别适合多因素、多水平的实验研究7 。本课题选择影响生川乌水煎液毒性的两个主要因素煎煮时间和给药剂量，每个因素选择 7 个水平，共进行 7 次实验，将实验结果多元回归分析，得出煎煮 30 min，给药剂量为
23、临床用量 120 倍时，对痹证动物的毒性最大同时药效最佳。该结果仅是应用统计方法得出的一个理论推测值，对于该结果的真实性、可靠性、重复性还要通过重复实验得到验证。本课题研究结果表明川乌水煎液的毒性作用对痹证模型大鼠病理组织学和血液生化学的影响较小。其长期毒性是否有可能体现在对神经系统或心血管循环系统功能的损害，或对机体其他组织功能的改变，还有待进一步研究。【参考文献】1田代华.实用中药辞典,第 1 版M.北京:人民卫生出版社，2002:177.2师海波,周重楚,李延忠，等.川乌总碱的抗炎作用J.中国中药杂志,1990,15(3):46.3宋东江,陆满文，李汉青.乌头碱类化合物毒理学研究概况J.中国药理学通报,1989,5(5):272.4王浴生.中药药理与应用,第 2 版M.北京:人民卫生出版社，1998:109.5何忠文,何平文.附子川乌草乌中毒 12 例辨析J.江西中医学院学报,2000,12(2):54.6万德光,彭 成,赵军宁.四川道地中药材志M.成都:四川科学技术出版社，2005:80.7方开泰.均匀设计数论方法在试验设计中的应用J.应用数学学报,1980,3(4):363.
