1、大白鼠提睾肌缺血再灌注后血管内皮细胞的凋亡基因表达【关键词】 睾丸 关键词: 睾丸;内皮，血管;细胞;脱噬作用;缺血再灌注 摘 要:目的 研究大白鼠提睾肌缺血再灌后血管内皮细胞的凋亡基因表达. 方法 以免疫组织化学 SP 法对大白鼠提睾肌缺血再灌注后血管内皮细胞 Bcl-2，Bax 及 p53 的表达进行观察. 结果 大白鼠提睾肌缺血再灌注的血管内皮细胞 Bax 及 p53 阳性细胞率（分别为 83%和 87%）明显高于 Bcl-2 和对照组（分别为 34%和 7%） ， （P0.01） ，再灌注 6h 阳性细胞最多. 结论 大白鼠提睾肌缺血再灌注可引起血管内皮细胞凋亡，并可能在微循环障碍中起
2、重要作用. Keywords:testis;endothelium，vascular;cells;apoptosis;reperfusion Abstract:AIM To study apoptotic gene expression of the endothelial cells in cremaster ischemia-reperfusion of the rat.METHODS Expression of Bcl-2，Bax and P53in endothelial cells of cremaster ischemia-reperfusion of the rat was in
3、vesti-gated by means of immunohistochemical SP method.RESULTS Positive expression rate of Bax（83%）and P53（87%）was much higher than that of Bcl-2（34%）and con-trol（7%，P0.01）and reached the hightest level6h after reperfusion.CONCLUSION Ischemia-reperfusion of the cremaster could induce the apoptosis of
4、 the endothelial cells and might play an important role in microcirculation disorder. 0 引言 在血管创伤、组织或器官移植中，因术后微循环障碍而使手术失败者时常发生.术后微循环障碍的产生因素目前认为是血管内皮细胞损伤及其引发的一系列病理生理改变，其中包括血小板和白细胞的凝集，产生微血栓、释放促凝因子及缩血管因子等.造成血管内皮细胞损伤的因素很多，除内毒素、自由基、外科创伤、Ca2+ 超载等外，细胞凋亡已开始受到许多学者的关注，认为异常的细胞凋亡也可引起血管内皮细胞的损伤及死亡1-3 .在外科创伤修复、组织和器
5、官移植手术中，血流的暂时阻断和血管吻合后的再灌注是否会引起血管内皮细胞的损伤和凋亡，参与术后微循环障碍，此方面还未见报道.因此，我们用大白鼠提睾肌微循环缺血再灌注模型，研究了细胞凋亡相关基因 bcl-2，bax 及 p53 在血管内皮细胞的表达，以探讨缺血再灌注后的血管内皮细胞的凋亡改变及其对微循环的影响和作用. 1 材料和方法 1.1 动物模型 成年雄性 SD 大鼠 35 只，体质量（25030）g，由本校实验动物中心标准饲养室提供.其中 30 只平均分为再灌注 0.5h，1h和 6h3 个实验组，另 5 只动物用做对照实验.实验组动物以10gL-1 ，ip 戊巴比妥钠溶液麻醉后，切开一侧腹
6、股沟区皮肤，显露提睾肌，从提睾肌外侧分离至其根部，寻找发自髂动脉的腹壁阴动脉及所有到提睾肌之小动脉，穿粗线结扎完全阻断血流 0.5h 后，松开结扎线，恢复血流，分别于再灌注后 0.5h，1h 及 6h 经主动脉插管灌流固定，依次灌入 9gL-1 生理盐水 150mL 和 40gL-1 多聚甲醛 250mL，将同侧提睾肌整体取下，置固定液后固定备用.对照组动物除不做血管阻断外，其他操作同实验组. 1.2 试剂 Bcl-2，Bax 及 p53 鼠抗单克隆抗体是 MBI 公司产品.链霉菌抗生素过氧化酶免疫组织化学染色超敏试剂盒购自福州迈新公司. 1.3 方法 与血管纵轴垂直切取提睾肌组织块、脱水、包
7、埋及石蜡切片，片厚 5m.切片经脱蜡和水化后，依次以双氧水阻断剂和正常血清室温孵育 10min，Bcl-2，Bax（140）和 p53（1100）单克隆抗体室温孵育 60min，生物素标记第二抗体和链霉菌抗生物素过氧化酶室温孵育各 10min.各步骤间均以 0.01molL-1 PBS 漂洗 1015min.最后以 DAB 反应 510min.自来水冲洗终止反应.除 p53 切片外，其余均以苏木精复染.切片脱水、透明和封片，光镜下观察.对照组动物标本实验方法同实验组.用 PBS 做阴性对照. 1.4 结果判定及统计学分析 条状血管内皮细胞胞质出现棕黄色颗粒状为 Bcl-2 及 Bax 阳性细胞
8、，血管内皮细胞核出现棕黄色颗粒为 p53阳性细胞.观察 10 个连续切片血管密集处的 5 个 400 倍视野，计数平均100 个细胞中的阳性细胞作为凋亡指数，以反映凋亡程度.所得各组数据以 x s 表示，采用 2 检验分析. 2 结果 2.1 Bcl2，Bax 和 p53 在血管内皮细胞的表达 Bcl-2 和 Bax 阳性细胞位于血管内皮细胞层，棕黄色阳性颗粒位于胞核两侧窄条状胞质及胞膜内外侧.阳性细胞多者可在血管内皮细胞层形成一整圈棕黄色结构（Fig1）.p53 阳性产物主要位细胞核，充满棕黄色颗粒的胞核呈椭圆状或梭形突入血管腔（Fig2）.但在胞质及核膜两侧也可见到阳性产物.在提睾肌再灌注
9、各时间组，p53 和 Bax 的阳性细胞数量明显高于 Bcl-2（P0.05，Tab1）.出现阳性表达的血管以中、小血管和肌束间毛细血管为主，血管常呈束状分布. 表 1 Bcl-2，Bax 及 p53 在血管内皮细胞的表达 略 2.2 缺血再灌注后不同时间阳性表达比较 Bcl-2，Bax 及 p53 在缺血再灌注各时间组的表达随时间的延长有所增加，特别是 Bax 和 p53 虽然在再灌注 0.5h 即可出现一定量的散在阳性细胞，但在再灌注 1h，阳性细胞明显增多，至再灌注 6h 阳性细胞数量达到高峰（P0.01，Tab1） ，呈束状中、小血管和肌束间毛细血管，从横断面或纵切面上观察阳性细胞十分
10、密集，几乎所有内皮细胞全为阳性. 图 1 图 2 略 3 讨论 有研究表明，组织细胞的缺血再灌注损伤是由氧自由基激活并 Ca2+ 超载等引起的.但还发现组织细胞缺血再灌注的缺氧可引起 ATP 水解酶升高而加速 ATP 水解，使其不能直接利用，从而造成细胞的功能和形态的损伤4 .另外，Ca2+ 超载还是细胞凋亡的诱导因素1 .血管内皮细胞的损伤除上述各种原因外，细胞凋亡是近几年受到重视的重要细胞生物学特性，并在细胞的损伤和死亡过程中起重要作用.本实验结果显示，大白鼠提睾肌缺血再灌注各时间内 Bax 和 p53 的阳性表达明显高于 Bcl-2，而在对照组则阳性细胞很少（P0.01）.研究证明，Bc
11、l-2 和 Bax通常以二聚体的形式存在，Bcl-2/Bax 的比率决定细胞的凋亡与否，高水平的 Bcl-2 表达说明存在大量的 Bcl-2/Bax 杂合体，从而能维持细胞的活性，而高水平的 Bax 表明存在更多的 Bax 同源体，故能诱导凋亡.p53是一个重要的凋亡调节物，其靶基因就是 bcl-2 和 bax，它的大量表达可诱发凋亡5-9 .本实验的 Bax 和 p53 高表达恰与此规律相符，大鼠提睾肌缺血再灌注可造成血管内皮细胞的过度凋亡.因此提示，在血管损伤修复后的微循环障碍与缺血再灌注后血管内皮细胞损伤和凋亡有关.Bax和 p53 在中、小血管和毛细血管的高表达可以说明，缺血再灌注后，
12、最易受到影响的是向组织细胞提供养分的末端血管，故可能是造成组织器官移植后坏死及手术失败的重要原因之一. 再灌注 0.5h，虽有阳性细胞，但数量不多，再灌注 1h 后，阳性细胞明显增多，至再灌注 6h 达最高水平，特别是 Bax 和 p53 更为显著.该结果提示，血管缺血再灌注血管内皮细胞凋亡发生早且发展迅速，有关血管的手术中如何防止凋亡的产生和延缓其加剧可能是缓解微循环障碍，提高手术成功率的重要因素之一.目前对缺血再灌注损伤的防治方法包括中西医治疗，缺血预处理等10 ，但缺血再灌注损伤的机制尚未完全清楚，有关问题还有待深入研究. 参考文献: 1OBrien PJ，Li Go，Locke M，K
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