1、蛋白转导功能域在肿瘤疫苗领域的应用前景作者：郭晓彤 张积仁 李立文 【关键词】 肿瘤 【摘要】 蛋白转导技术是近些年迅速发展起来的一种跨膜转运技术. 应用该技术可以将多种药物，包括化合物、多肽、核酸等，高效地转运到细胞内，其过程不依赖于能量和受体，而是由在生理 pH 条件下带正电荷的、富含碱性氨基酸残基的多肽序列即蛋白转导功能域所介导. 目前蛋白转导技术已经不仅仅是一种可以提高药物进入细胞效率的药物转运技术，而且被广泛用做肿瘤基因治疗的辅助手段来增强对肿瘤组织的杀伤效率. 最近研究表明，HIV1 TAT, HSV1 VP22 和果蝇触角足同源蛋白等的蛋白转导功能域尚可引导与之融合表达或共价结合
2、的抗原进入 MHC I类分子依赖的抗原提呈途径，并显著提高抗原特异性 CTL 的产生水平，其作用机制涉及介导抗原在细胞内和细胞间播散、增强抗原表达水平、促进 CTL 表位的加工和释放并提高抗原表位向细胞表面的提呈等. 这些资料表明蛋白转导功能域可以显著提高肿瘤疫苗的免疫效能，激发机体产生高水平的抗原特异性 CTL，从而对肿瘤组织产生最大的免疫杀伤效应. 【关键词】 蛋白转导；肿瘤，疫苗；应用前景 0 引言 蛋白转导技术是指利用蛋白转导功能域将与之共价结合的化合物、肽、核酸或与之融合表达的全长蛋白质通过非受体依赖、非转运蛋白依赖、非能量依赖方式运送至细胞内的一种技术. 蛋白转导作用不是通过全长蛋
3、白发生的，而是依赖于长约 1016 个氨基酸残基、富含碱性氨基酸残基、在生理 pH 值条件下带净正电荷的氨基酸序列，该序列即被称为蛋白转导功能域(protein transduction domain, PTD). 现已发现多种蛋白或多肽含有 PTD，如 HIV1 TAT, HSV1 VP22 以及果蝇触角足同源蛋白（Drosophila Antennapedia homeoprotein，pANTP）等，其中对 HIV1 TAT, HSV1 VP22 的研究报道较多. 最近研究表明蛋白转导技术不仅可显著提高药物进入细胞的效率，而且可作为肿瘤基因治疗的辅助手段来提高对肿瘤组织的杀伤效率，还可以
4、引导特定抗原进入 MHC I 类分子依赖的抗原提呈途径，显著增强肿瘤疫苗的免疫效能. 本文我们对蛋白转导功能域和其在肿瘤疫苗研究领域的应用做一简单介绍. 1HIV1 TATPTDHIV1 TATPTD 是指位于 TAT 蛋白第 47 至第 57 个氨基酸残基组成的多肽序列，其中包含 9 个碱性氨基酸残基，在生理 pH 值条件下带较高正电荷，可与细胞表面的硫酸肝素等分子作用，使蛋白发生跨膜运动. 现已成功应用 TATPTD 将多种蛋白包括铜锌超氧化物歧化酶、增强型绿色荧光蛋白、抗凋亡蛋白 BclXL 和 PEA15 等转运入多种类型的人或小鼠细胞. 1996 年 Moy 等1以卵清蛋白作为模型抗
5、原首次证实 HIV1 TAT 可以引导抗原进入 MHC I 类分子依赖的抗原加工和提呈途径，其激发机体产生抗原特异性 CTL 的能力与在体表达卵清蛋白激发的免疫反应相当. 次年 Kim 等2使用 TATPTD 与卵清蛋白共价交联后加载于树突状细胞也获得了相同结果，表明 TATPTD 可以通过将蛋白抗原转位至树突状细胞的胞质，从而使之以依赖抗原加工相关转运体(transporter associated with antigen processing，TAP)的方式高效进入 MHC I 类分子依赖的抗原提呈途径. 进一步研究发现，HBc18-27 表位虽然可通过竞争性结合细胞表面的 HLAA2
6、分子来有效抑制 CEA691 表位对靶细胞的致敏能力，但对CEA691TATPTD 融合肽的致敏能力没有任何影响，表明 CEA691TATPTD 融合肽必须经细胞内加载过程才能致敏靶细胞，同时胰酶降解试验证实其作用依赖于 HIVTATPTD 的完整性3. 应用淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)的 CTL 表位 NP118 作为模型抗原进行研究发现，TATPTDNP118 肽能够以 TAP 非依赖方式进入 MHC I 类分子抗原提呈途径，而使用编码表达 TATPTDNP118 的质粒作为基因疫苗时，即在细胞内表达产生 TAT
7、PTDNP118 肽时，该融合抗原则依赖于蛋白酶体和 TAP 进入 MHC I 类分子抗原提呈途径. 同时发现 TATPTD 可提高抗原提呈速度、减少用于刺激 CD8+ T 细胞反应所需的抗原提呈细胞数量，增强激发抗原特异性 CTL 反应的能力，并证实了交叉提呈不在该过程中发挥主要作用4 ，推测可能与 TATPTD 增强抗原表位向细胞表面提呈有关5. 应用 TATPTDTRP2 多肽抗原致敏树突状细胞，可使小鼠获得针对 B16 肿瘤的保护性免疫，比使用 TRP2 多肽时所诱发的抗原特异性 CTL水平约高 310 倍，T 细胞亚型耗竭实验和基因敲除小鼠实验均证实抗瘤免疫依赖于 CD4+和 CD8
8、+ T 细胞的同时存在6. 在另一研究中，接种重组 TATPTDTRP2 融合抗原可抑制约 58%的小鼠肿瘤生长，而单纯接种TRP2 时仅为 35%7. 加载 TATPTDHer2/neu 胞外功能域融合蛋白的树突状细胞可有效激发患者淋巴细胞产生 Her2/neu 特异性抗瘤免疫8. 此外在对日本脑炎病毒非结构抗原的研究中，也发现 HIV1 TATPTD 可增强非结构抗原激发特异性抗病毒免疫的能力9. Lu 等还利用 furin 敏感接头构建了多个表位与 HIV 1 TAT PTD 的融合疫苗，并证实 furin 敏感性接头是引发多个表位同时发挥作用的关键所在10. 那么 HIV1 TATPT
9、D 能否增强全长蛋白的免疫效果呢？利用 LCMV 核蛋白作为模型抗原研究发现，该抗原与 HIV1 TATPTD 融合并不能增强其免疫原性，而且不能提高全长蛋白编码表位的提呈作用，然而 TATPTD 和LCMV 核蛋白中的 NP396 表位融合表达却能够大大提高对 NP396 表位的提呈作用11. 在使用卵清蛋白作为模型抗原的研究中却发现，TATPTD卵清蛋白融合抗原可有效被树突状细胞加工提呈，并可激发高水平的抗原特异性 CTL 反应12. 此外以人乳头瘤病毒 16 型(human papillomavirus type16，HPV16)的 E7 抗原为模型抗原的研究也表明E7TATPTD 融合
10、抗原诱发保护性免疫的能力显著高于单独应用 E7 抗原13. 应用不同的模型抗原得出了不同的结果，其原因尚待阐明. 2HSV 1 VP22VP22 是构成人 HSV1 成熟病毒颗粒被膜和衣壳之间的病毒衣被的主要成分. VP22 由 UL49 基因编码，为一碱性蛋白，Mr 约为 38103，有磷酸化和非磷酸化两种形式，参与细胞间运输、与微丝结合、诱导细胞骨架萎陷，而且还参与有丝分裂过程中核转位、与染色质和核膜结合等. 尽管 VP22 本身无信号序列，但其却可通过非典型的非高尔基体依赖的分泌方式从其合成细胞运送至胞外，而后又被细胞高效摄入. 现已证实，VP22 作为外源蛋白加入培养基后可被细胞直接摄
11、取，且可将绿色荧光蛋白、p53, 人单纯疱疹病毒胸苷激酶和 半乳糖苷酶等大分子蛋白转运至 COS1, Hela 和 BHK21 等细胞内. Cheng 等14发现应用 HPV16 E7 抗原做为模型抗原与 VP22 融合可显著增强基于 Sandbis 病毒的 RNA 疫苗的免疫效能，其激发的抗原特异性 CTL 可有效杀伤表达 E7 的肿瘤细胞，其机制可能涉及直接激发（direct priming）和交叉激发（ cross priming）. Hang 等使用pcDNA3 作为疫苗载体制备基因疫苗免疫小鼠，证实 VP22 与 E7 抗原融合后诱发 E7 特异性 CD8+ T 细胞前体的能力比单独
12、使用 E7 抗原增强约 50倍，而使用没有蛋白转导功能的截短型 VP221267 则没有任何免疫增强作用，同时各接种组的 E7 抗原特异性抗体反应没有显著差异15. Michel 等16也证实 VP22 可显著增强 HPV16 E7 抗原的免疫原性，并认为融合抗原表达水平的提高参与增强机制. 此外使用 VP22 尚可诱发较高水平的 E7 特异性 CD8+记忆 T 细胞，显著延长了保护性抗瘤免疫的持续时间17. 以上资料表明 VP22 介导的 E7 抗原在细胞内及细胞间播散以及融合抗原的表达水平是决定其增强激发抗原特异性 CTL 能力的关键因素. 使用牛疱疹病毒编码的 BVP22 与黄色荧光蛋白
13、(yellow fluorescent protein，YFP)融合蛋白基因疫苗肌肉注射免疫小鼠后可激发较强的 Th1 免疫反应，同时获得高水平的 YFP 特异性 CTL 反应18. 与 HSV1 VP22 有较高同源性的、由 I 型 Marek 氏病毒 UL49 基因编码的VP22 蛋白也可有效增强 HPV16 E7 抗原的免疫原性19. 3pANTP PTD 果蝇触角足同源结构域存在于果蝇触角足同源蛋白(homeoprotein)家族，该家族成员是参与发育过程的一组转录因子，并通过高度保守的、位于羧基末端、由 60 个氨基酸残基构成的且排列成 3 个 螺旋的同源结构域(homeodomai
14、n)来识别并结合 DNA，该同源结构域可转位穿过神经元细胞膜并进入细胞核. 进一步研究发现在该同源结构域中仅由 16 个氨基酸残基构成的第三个 螺旋即具有此转位活性，故被称为果蝇触角足蛋白转导功能域(pANTP PTD). pANTP PTD 与 CTL 表位 pCw3 或流感病毒衣壳蛋白 147156 肽的融合蛋白可引导抗原肽进入 MHC I 类分子依赖的抗原提呈途径，使用融合蛋白免疫小鼠后可激发抗原特异性 CTL 反应，然而其在体的免疫激发作用依赖于十二烷基硫酸钠（SDS）的存在. 由于 SDS 不能作为免疫佐剂用于人体，故作者对接种方法进行了优化，发现使用脂质体不仅能够避免融合抗原在血清
15、中的降解，而且可辅助融合抗原进入 MHC I 依赖的抗原提呈途径20 ，另外应用 CpG 免疫刺激序列可进一步提高接种效果. Pietersz 发现 pANTP PTD 与卵清蛋白 SIINFEKL CTL 表位的融合肽可迅速被抗原提呈细胞内化，免疫 C57BL/6 小鼠后可激发 CTL 反应并获得对表达卵清蛋白的 E.G7OVA 肿瘤的保护性免疫21. 接种 pANTP PTDgp100209 融合多肽也可有效激发抗原特异性 CTL 反应，其机制涉及内肽酶 furin 和氨肽酶、羧肽酶在分泌途径中加工、释放 CTL 表位1. 此外 pANTP PTDOVA257264 融合抗原尚可通过涂抹于
16、刮除角质层的皮肤来达到接种效果22. 综上所述，蛋白转导功能域可有效增强表位疫苗的免疫原性，显著提高激发抗原特异性 CTL 反应水平，在发展新型肿瘤疫苗中有很高的应用价值和临床应用前景. 然而，在设计疫苗时蛋白转导功能域、抗原表位、融合方法以及接头的选择等都会直接影响到疫苗的免疫效能. 此外，如何提高融合抗原在细胞内的表达水平并延长其半衰期，也是合理设计疫苗时必须考虑的关键因素. 【参考文献】 1 Moy P, Daikh Y, Pepinsky B, et al. Tatmediated protein delivery can facilitate MHC class I presenta
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