1、敌敌畏纳米乳剂和普通乳油的施药周期对德国小蠊抗性相关酶活性抑制作用的对比研究【摘要】 目的 探讨敌敌畏 (DDVP)纳米乳剂和乳油的施药周期对德国小蠊抗性相关酶活性的影响。方法 紫外分光光度法测定德国小蠊相关酶活性，采用轮廓分析研究纳米乳剂、乳油的施药周期与酶活性的关系。结果 施药前后 DDVP 纳米乳剂组、乳油组对德国小蠊酶乙酰胆碱酯酶(AchE)、1-NA 和酸性磷酸酯酶(ApE)活性影响不同，平行性检验显示可以认为两杀虫剂对各酶的轮廓分析不同，F 值分别为 159.76、317.22 和2555.50(P 值均小于 0.05)。结论 DDVP 纳米乳剂、乳油施药后对德国小蠊 AchE、1
2、-NA 和 ApE 活性的影响趋势不同。 【关键词】 敌敌畏 纳米乳剂 普通乳油 施药周期 德国小蠊 抗性相关酶目前已知道敌敌畏(DDVP)纳米乳剂与乳油的施药量对德国小蠊(German Cockroaches)乙酰胆碱酯酶(AchE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和碱性磷酸酯酶(ApE)活性的影响不同。德国小蠊酶活性改变不但与杀虫剂的种类和施药浓度有关，还与杀虫剂施药周期长短有关1-2 。因此，有必要对敌敌畏纳米乳剂与乳油的施药周期对德国小蠊相关酶活性的影响做一对比性研究，以便了解敌敌畏纳米乳剂杀灭德国小蠊的作用机理与乳油是否相同，进一步探讨敌敌畏纳米乳剂的毒性作用。本实验旨在通过微量点滴
3、法，观察敌敌畏纳米乳剂、乳油的施药周期对德国小蠊相关酶活性的影响，进一步探索敌敌畏纳米乳剂对德国小蠊的毒作用机理。1 材料与方法1.1 试剂 TritonX-100：上海化学试剂厂产品；碘化硫代乙酰胆碱、5，5-二硫双硝基苯甲酸(DTNB)：Sigma 公司产品；a-乙酸萘酯(1-NA)、1-萘酚：上海试剂一厂产品；对硝基苯磷酸二钠、固蓝 B 盐、考马斯亮蓝：Fluka 公司产品；80%敌敌畏原油：南京电化厂产品；DDVP纳米乳剂：本试验室自行研制，乳液呈浅黄色，透明、均匀、不分层，乳油粒径约为(11.21.9)nm，稀释 10000 倍后其粒径范围为76103nm。原液理化性质稳定，(-20
4、2)和(522)下储藏 14d，室温下放置 2 个月均未发生浑浊，稀释液使用时现配；其它试剂均为国产分析纯或化学纯。1.2 供试虫源及施药方法 德国小蠊由江苏省疾病预防控制中心昆虫饲养室提供。选用羽化后的健康成年雄虫，采用微量点滴法施药(死亡率为 0 或低于 5%)。以微量点滴器将 1L(0.0001%)量点滴在试虫胸腹背板上，点滴后将试虫放入洁净果酱瓶中，正常饲养。用不施加任何药物的德国小蠊作对照，不同施药浓度的德国小蠊作为实验组。1.3 酶活性的测定1.3.1 酶源制备(1)AchE 酶源制备：将待匀浆的德国小蠊用流动的蒸馏水冲洗，在滤纸上吸干后，取头部，加 1/15mol/L(pH8.0
5、)含有 0.5%的 TritonX-100 的磷酸盐缓冲液冰浴匀浆，然后再以 4000r/min 离心 15min，取上清液作酶源。(2)1-NA 酶源的制备：待匀浆德国小蠊用流动蒸馏水冲洗，以滤纸吸干，4下解剖，去消化道中食物，取中肠制备酶源。于磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.04mol/L)中冰浴匀浆，在 3000r/min 离心 10min 后，取上清液作酶源。(3)ApE 酶源制备：取中肠，pH4.6 醋酸缓冲液(0.1mol/L)中冰浴匀浆，8000r/min 离心 15min 后，取上清液做酶源。1.3.2 酶活性的测定(1)AchE 活性的测定：按 Groun 改进的 Ellman
6、 方法3 ，反应体系终体积 0.2mL，10L 的 1/15mol/L pH8.0 的磷酸盐缓冲液，50L 的0.75mmol/L 底物(碘化硫代乙酰胆碱)，50L 酶源(调整蛋白含量在4080g/mL)，30反应 15min，加入 1.8mL DTNB-磷酸盐-乙醇试剂，412nm 波长下进行比色测定。(2)1-NA 酶活性测定：参照 Michael 和杨俭美报道的方法4-5 ，3.6mL 1-乙酸萘酯(3104mol/L)加 100L 酶液后，加 0.9mL 磷酸盐缓冲液(pH7.0)，30反应 15min 后，加 1mL DBLS 试剂(1%固蓝 B 盐水溶液与 5%十二烷基硫酸钠水溶液
7、，使用前以 25 混合)，15min 后在波长600nm 处测定光密度，用 1-萘酚制备标准曲线，定量反应产物的量。(3)ApE 活性测定：以对硝基苯磷酸二钠作为底物，配制成0.7510-2mol/L 水溶液。测定酸性磷酸酯酶活性的反应混合物为：2.3mL pH4.6 醋酸缓冲液(0.1mmol/L)、0.5mL 底物和 200L 酶液。在37保温 30min 后，用 2mL NaOH(0.1mol/L)终止反应，400nm 处用热灭活后酶液作对照测定 OD 值，对硝基酚制备标准曲线6 。1.3.3 蛋白浓度的测定 按 Bradford 方法7 ，取 0.1mL 酶液，加入 5mL 考马斯亮蓝
8、，595nm 处测 OD 值，在标准曲线上查得其对应的蛋白浓度。1.3.4 数据处理 用 SAS 9.0 软件进行重复测量资料的轮廓分析。2 结果2.1 两种 DDVP 乳液对德国小蠊 AchE 的影响对比(表 1)表 1 DDVP 纳米乳剂和乳油的施药周期对德国小蠊 AchE 活性的影响（略）随着施药周期延长，DDVP 纳米乳剂组的 AchE 活性随施药时间延长呈波动性抑制趋势，至施药后第 18 天 AchE 活性仍表现为降低趋势；而乳油组的 AchE 活性在第 3 天时受到最大抑制，而后酶活性开始逐渐恢复。采用 SAS 9.0 软件按施药类型分组作重复测量资料的轮廓分析，对处理因素主效应(
9、施药)进行分析结果可推断：可以认为两杀虫剂施药前后德国小蠊 AchE 活性不同(F=193.13，P0.05)；平行性检验显示可以认为两组轮廓不平行，即两杀虫剂对德国小蠊 AchE 的影响趋势不同(F=159.76，P0.05)。2.2 两种 DDVP 乳液对德国小蠊 1-NA 的影响对比(表 2)表 2 不同施药周期 DDVP 纳米乳剂和乳油对德国小蠊 1-NA 酶活性的影响（略）随着施药周期延长德国小蠊 1-NA 酯酶在 DDVP 纳米乳剂的作用下先呈波动性改变，至施药第 8 天以后 1-NA 酶活性开始抑制，直至施药后第 18 天酶活性仍低于对照组。乳油组的 1-NA 酯酶活性在杀虫剂作
10、用下未出现抑制，施药后第 8 天受诱导的酶活性开始恢复，但至第 18 天仍然高于对照组。采用 SAS 9.0 软件按施药类型分组轮廓分析，从处理因素主效应(施药)分析结果可推断：可以认为两杀虫剂施药前后德国小蠊酶 1-NA 酶活性不同(F=271.47，P0.05)；平行性检验显示可以认为两组轮廓不平行，即两种杀虫剂对德国小蠊 1-NA 酶的影响趋势不同(F=317.22，P0.05)。2.3 两种 DDVP 乳液对德国小蠊 ApE 的影响对比(表 3)施药后第 1 天 ApE 的活性在 DDVP 纳米乳剂的作用下被激活，酶活性迅速升高，而后酶活性降低，直至施药后第 18 天酶活性逐渐抑制；D
11、DVP乳油组的 ApE 施药后第 1 天出现降低，而后酶活性呈现强烈诱导，至第18 天时酶活性仍然未恢复到原来水平。按施药类型分组作轮廓分析，对处理因素主效应(施药)分析：可以认为两杀虫剂施药前后德国小蠊 ApE 活性不同(F=2242.80，P0.05)；平行性检验显示可以认为两组轮廓不同，即两种杀虫剂对德国小蠊 ApE的影响趋势不同(F=2555.50，P0.05)。表 3 不同施药周期 DDVP 纳米乳剂和乳油对德国小蠊 ApE 活性的影响（略）3 讨论AchE 是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂靶标酶，AchE 的改变会导致昆虫对有机磷和氨基甲酸酯类的敏感性降低，使该酶不受抑制从而产生抗性8
12、-10 。以往的研究已知 DDVP 纳米乳剂、乳油的施药量与 AchE 的抑制率呈正相关，且纳米乳剂对 AchE 的抑制作用比乳油要高。在本次研究中，随施药时间的延长 DDVP 纳米乳剂对德国小蠊 AchE 呈波动性的抑制作用，其作用方式完全不同于普通乳油。DDVP 纳米乳剂对酶活性的这种波动性抑制作用，可能与纳米乳剂将活性物质(DDVP 油相)包裹在内核，导致药物缓释有关。1-NA 酶和 ApE 是 DDVP 的重要代谢酶，德国小蠊对 DDVP 抗药性的产生与这两种酶活性的增高密切相关2 。本次实验中 DDVP 纳米乳剂组施药后 1-NA 酶活性呈波动性升高，特别是施药后第 13 天，纳米乳
13、剂施药组的德国小蠊 1-NA 酶活性受到严重抑制，酶活性显著低于对照组，而乳油组的酶活性无明显降低，仍然高于对照组。ApE 的活性在施药第 1 天迅速升高，而后却逐渐被抑制，直至施药后第 18 天酶活性比对照组还低，说明 DDVP 纳米乳剂能够有效抑制 ApE 活性，而乳油施药后 ApE 呈现强烈诱导，酶活性不断上升，虽然第 13 天后有所下降，但仍高于对照组。表明 DDVP 纳米乳剂对德国小蠊 1-NA、ApE 的抑制作用更强。综上所述，DDVP 纳米乳剂对德国小蠊的毒性作用与乳油完全不同，但德国小蠊对 DDVP 纳米乳剂的抗性产生速度是否比普通乳油要慢还需进一步证实。【参考文献】1 张丽，
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