1、反相高效液相色谱光电二极管阵列检测器法测定苦丁茶中乌索酸的含量【摘要】 目的建立苦丁茶中乌索酸含量的测定方法，同时采用光电二极管阵列检测器检测乌索酸色谱峰的纯度。方法色谱柱为 Nucleosil C18 柱(4.6 mm250 mm, 5 m)，流动相为甲醇 水(8713)，流速0.8 ml/min，检测波长 210 nm，柱温 26。结果乌索酸在1.63617.724 g（r=0.999 8）范围内峰面积与进样量呈良好的线性关系，乌索酸的平均回收率为 99.3 % (RSD 为 1.7 %)。结论 该方法样品处理简单，准确度高，分离效能好，适合于苦丁茶叶中乌索酸含量的测定。 【关键词】 苦丁
2、茶；乌索酸；高效液相色谱；光电二极管阵列检测器Determination of Ursolic Acid in Ilex kudincha by RPHPLCPADZOU Shengqin, CHEN Wu*,WU XiaochunBioengineering Research Institute of Yichun UniversityKey Laboratory of Province for Research on Active Ingredients in Natural Medicines,Yichun,336000,ChinaAbstract：ObjectiveTo develop
3、 a method for the quantitative analysis of ursolic acid and oleanolic acid in Ilex kudincha C. J. Tseng and at the same time the purity of ursolic acid peak was detected by means of Photodiode Array Detector(PAD).MethodsHPLC was carried out on the Nucleosil C18 column (4.6 mm250 mm, 5 m) at 26 with
4、MeOHH2O(8713) as mobile phase. The flow rate was 0.8 ml and the detection wavelength 210 nm. ResultsThere was good linear relationship between the peak area and the sample content injected in the ranges of 1.63617.724 g（r=0.999 8）for ursolic acid. The average recovery rate of ursolic acid was 99.3%
5、(RSD1.7 %). ConclusionThe method is simple, accurate, and suitable for the determination of ursolic acid in Ilex Kudincha C. J. Tseng.Key words:Ilex kudincha C. J. Tseng ; Ursolic acid; HPLC; PAD苦丁茶 Ilex kudincha C. J. Tseng 为冬青科(Aquifoliaceae)冬青属植物，性凉，味甘苦，有散风热清头目、除烦渴的功效。苦丁茶主要分布在广东、广西、湖南、湖北、海南等地，是我国
6、南部及西南部民间传统的天然药用植物，具有清热解毒、生津、提神、益智、抗衰老、调节血压、降脂等药理作用1 。苦丁茶主要含三萜类、黄酮类、木脂素、氰基化合物、甾醇、氨基酸和苦味素等化学成分2 。现代药理研究表明，苦丁茶中的乌索酸具有抗肝炎、抗肿瘤、抗病毒、抗炎抑菌及降血脂血糖等多种药理活性，具有重要的药用开发价值3 。苦丁茶药理、化学成分研究已有很多报道，但其质量评价方法报道较少。本实验采用高效液相色谱法对不同产地苦丁茶产品中的乌索酸含量进行了测定，为评价其质量提供依据。1 仪器与试药1.1 仪器高效液相色谱仪，Waters515 型泵，2996 光电二极管阵列检测器，7725I 进样阀，Empo
7、wer 中文色谱工作站（美国） ；RO-MB-10D 高纯水机（杭州永洁达膜分离设备厂） ；CP2250 分析天平（德国 Sartorius 公司） ；FW100 型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司） ；KS-1500 超声提取仪器（宁波科盛仪器厂） 。1.2 试药甲醇为色谱纯（上海陆忠试剂厂） ，水为高纯水，乙醇为分析纯（95%，江西同盟试剂化工厂） ，乌索酸对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号 110742-200314，供含量测定用） 。苦丁茶(市售)，经鉴定为冬青科植物苦丁茶 Ilex Kudincha C. J. Tseng 的叶。2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱 N
8、ucleosil C18 柱(4.6 mm250 mm, 5 m)；流动相为甲醇-水（8713，V/V） ；流速为 0.8 ml/min；检测波长为 210 nm；柱温为 26C。乌索酸理论塔板数大于 10000，分离度大于 1.5。对照品溶液及苦丁茶样品溶液的 HPLC 色谱见图 1。2.2 溶液的制备2.2.1 混合对照品溶液的配制 精密称取干燥至恒重的乌索酸对照品 8.18 mg，置于 10 ml 容量瓶中，加流动相溶解，定容，作为乌索酸对照品混合溶液。2.2.2 样品溶液的配制 取苦丁茶样品于 80恒温干燥 10 h，粉碎，精密称取约 3 g，加入 95 %乙醇溶液 40 ml，超声提
9、取 60 min，冷却至室温，滤过，滤渣用乙醇超声洗涤 2 次，合并过滤液于 50 ml 容量瓶，乙醇定容，摇匀，经 0.45 m 微孔滤膜过滤，得样品溶液。2.3 线性关系实验精密吸取对照品溶液 2，6，10，14，18 l，按 2.1 项下色谱条件进样并测定峰面积。以峰面积对进样量进行线性回归，乌索酸回归方程为：Y=5.62105X+1.36105，r=0.999 8。表明乌索酸进样量在 1.63617.724 g 之间时，线性关系良好。2.4 色谱进样精密度实验精密吸取乌索酸对照品溶液 10 l 进样，平行 5 次，测得乌索酸峰面积相对标准偏差（RSD）为 0.9%（n=5） ，表明仪器
10、精密度良好。2.5 方法重现性实验精密称取苦丁茶样品 5 份，制备样品溶液，在上述色谱条件下，精密吸取 10 l 进样分析，测得乌索酸峰面积的RSD 为 0.8 %（n=5） ，方法重现性良好。2.6 加样回收率实验精密称取已知乌索酸含量并干燥至恒重的样品（广西钦州）5 份，分别加入适量的乌索酸对照品，制备加标样品溶液，进样分析，计算乌索酸加样回收率。乌索酸平均加样回收率结果见表 1。表 1 乌索酸加样回收率实验结果（略）2.7 乌索酸色谱峰纯度分析选取相同积分参数，采用 Empower 软件系统适应性模块对对照品和样品溶液中的乌索酸色谱峰积分，分析峰纯度，对照品和样品的乌索酸色谱峰纯度图中纯
11、度线均位于自动阈值线下方（图 2） ，色谱峰纯度角值小于阈值，证实乌索酸色谱峰为单一组分吸收峰，与色谱峰顶点、起始点和终止点光谱归一化叠加后结果相吻合4 。2.8 样品中乌索酸含量测定结果精密称取苦丁茶样品约 3 g，制备样品溶液。精密吸取样品溶液 10 l，分别进样，平行实验 3 次，测定乌索酸峰面积，外标法计算乌索酸含量。结果见表 2。表 2 样品中乌索酸的测定结果（略）3 讨论3.1 植物中乌索酸的提取多采用乙醇回流法、索氏提取法，提取时间长，原料和试剂的使用量大，成本高，且溶剂易挥发污染环境。本实验尝试采用超声提取法，实验结果表明该法对样品处理过程简单，提取率高，与传统的样品预处理方法
12、相比，具有快速、环保、高效等优点。3.2 取对照品和苦丁茶样品溶液进样，在 190500 nm 波长范围进行光谱扫描，乌索酸在流动相中的最大紫外吸收波长均为 204.5 nm (图 3)，但由于流动相在短波长处有末端吸收。为了消除背景，提高信噪比，提取不同波长的色谱图进行比较，选择 210 nm 为检测波长信噪比高，峰形好，干扰小，最大限度地保证了分析结果的准确。3.3 利用二极管阵列检测器采集立体数据的性能，在分析结果中察看并对比对照品与样品相应色谱峰的光谱图，比较两者的形状与最大吸收波长，用以增强色谱分析的定性能力，克服了单独采用色谱峰保留时间定性的缺点，解决了传统色谱分析过程中定性技术的
13、缺陷5，6 。3.4 采用 RP-HPLC-PAD 法测定苦丁茶中乌索酸的含量，可同时对待测组分的色谱峰进行纯度分析。方法准确、灵敏、重现性好、数据可靠，适用于苦丁茶的质量评价和控制。【参考文献】1王 新,陆慧宁,林少琨.苦丁茶冬青叶化学成分及药理作用研究进展J.天然产物研究与开发,2005,17(3)：366.2蒋建敏,许实波.苦丁茶化学成分和药理作用研究进展J.时珍国医国药,2000,11(1)：92.3陈 武,李开泉,熊筱娟,等.乌索酸的药理作用研究J.宜春学院学报,2003,25(4)：1.4邹盛勤.高效液相色谱-光电二极管阵列检测器法测定齐墩果酸原料及片剂中齐墩果酸的含量J.时珍国医国药,2006,17(3):357.5王 骏,胡 梅,祝建华.二极管阵列检测器在农药液相色谱分析中的应用J.农药,2006, 45(7)：466，469.6高志杰,李静涛,饶小思.高效液相色谱-二极管阵列检测器法检测饮料中 Vc 的研究J.中国卫生检验杂志,2006,16(4)：446.
