1、肺栓塞动物实验模型简述【摘要】肺栓塞(pulmonary embolism,PE)是内源性或外源性栓子阻塞肺动脉引起肺循环障碍综合征，临床的误诊率和死亡率均很高。目前主要进行的是回顾性分析研究，以动物实验研究为主，肺栓塞的动物模型制备方法主要包括体内血栓形成法和体外血栓形成法两种。 【关键词】 肺栓塞 疾病动物模型 1 前言 肺栓塞(pulmonary embolism,PE)是内源性或外源性栓子阻塞肺动脉引起肺循环障碍的临床和病生理综合征。PE 的栓子 99%为血栓性质1。其病理、病理生理、临床表现与血栓的大小、形状及堵塞肺血管床的部位和范围有关,因而表现出不同的临床类型,即猝死型、急性肺心
2、病型、肺梗塞型和不可解释的呼吸困难型2。在全世界范围内,急性血栓性肺栓塞及其原发病深静脉血栓形成的罹患者已达数百万,且发病急、病情重,严重威胁着人类的生命和健康3。 2 肺栓塞病生理 目前对肺栓塞的病理生理学改变已有广泛研究,其变化复杂多变,主要是影响呼吸系统、血流动力学及血管内皮功能，从而产生一系列心肺功能异常及血管内皮功能的改变4,引发多种临床表现，严重者可危及生命。影响 PTE 的严重程度主要取决于以下三方面因素：(1)栓子的大小、栓塞的部位和程度多发栓子的递次栓塞间隔和栓子溶解速度等栓塞相关因素。(2)神经-体液因素:栓子表面的血小板活化并脱颗粒，释放各种血管活性物质，如 5-羟色胺、
3、血栓素 A2、组织胺、血小板活化因子和 12-脂氧化酶产物等。同时此后两者又可诱发中性粒细胞释放血小板活化因子和花生四烯酸代谢产物。上述各种介质具有收缩肺血管作用, 使肺动脉压力增高和血管通透性改变5。近期国内发表的一组动物实验结果显示,PTE（肺动脉血栓栓塞）后有血栓形成,栓塞后病理改变取决于血栓的形成、溶解、机化三者间的作用，内皮素代谢障碍和血栓素 A2 升高在发病中具有重要作用6。(3)基础心肺功能条件也影响 PTE 的程度。 3 肺栓塞动物模型 由于其误诊率高，且尸检率低，很难进行较大样本的研究，目前国内对肺栓塞的临床回顾性分析研究并未取得较大进展。所以对其发病的病理生理及治疗基础性研
4、究主要借助于动物实验。 动物模型的制备方法可分为两种，即体内血栓形成法和体外血栓形成法。前者在血管内原位形成血栓，包括颈静脉股动脉、股静脉、冠状动脉，血栓形成后通过血流在肺动脉阻塞血管并形成栓塞。体外血栓形成法是在体外制备血凝块，将血凝块注入体内，形成肺栓塞的模型。实验动物包括鼠、兔、犬、猪等7。早期国外多选择犬来建立肺栓塞模型，因为犬体积大，操作方便，不足是实验成本高,犬类性凶猛 8-11 。随着分子生物学的发展,近年来多选用大鼠 12-13,但同时也暴露出体积小、操作难的缺点。目前应用较多的为家兔肺栓塞模型，其体形适中且成本低，模型建立便捷。 现就动物模型的制备及应用综述如下： 3.1 家
5、兔肺栓塞模型 家兔肺栓塞模型是目前最为成熟和普遍的方法,且已经证明兔的纤溶系统比狗和猪的更接近于人体纤溶系统,所以兔的肺栓塞模型也是最为理想的模型。由于该法是在体外形成血栓注入体内,所以相对于人体在形成肺栓塞时常有高凝状态,凝血机制失衡引起,该模型没有体现出机体的高凝状态,故仍有不足之处。 Nowak 法 体内血栓形成法是指在外周血管中形成血栓,让栓子通过血液流动到达肺动脉,阻塞肺动脉,形成栓塞，最为成熟的方法为Nowak 法,具体方法如下:家兔麻醉后,游离出一侧颈静脉和一侧颈总动脉,动脉插管和静脉插管,其中,动脉插管和静脉插管用三通管相连,三通管另一端与 1ml 注射器相连,注射器内吸取有
6、0.6ml 凝血酶（10NIH 凝血酶U/ml）,开启动脉插管和注射器之间的通道,使血液流入注射器内 1ml,关闭该通道,取下注射器振摇数次,使凝血酶和血液充分混匀,然后将凝血酶处理后的血液再通过三通管注入颈静脉,注意此时一定要夹闭颈静脉10min,待血栓形成后,移去静脉夹,释放栓子,栓子随血液流动到达肺动脉,即可形成肺栓塞模型。由于该法模拟了肺栓塞发病时的血液高凝状态,所以更能较体外血栓形成法准确反映机体状况,但该法形成肺栓塞后的长期观察却鲜有报道,肺栓塞形成后血管的复通率、模型的持久性等问题仍有待于进一步研究探讨。 碘标记法（Lodogen 法）国外近年来常用 I 标记纤维蛋白原后,再把含
7、有 125I 的纤维蛋白原和凝血酶混合,制成 125I 标记的血凝块,然后注入动物体内,标记常用 Lodogen 法14,具体步骤如下:取 Lodogen液,用三氯甲烷溶解，室温下氮气吹干制成反应管,加入纤维蛋白溶液,立即加入 Na125I11.110Bq,充分振荡混匀,标记反应混合物加至凝胶柱层析脱碘,磷酸缓冲液洗脱。留取标记纤维蛋白原峰洗脱液,-20保存备用,控制放射性比活度在 2.7810Bq/mg 左右确保纤维蛋白原有良好的凝血酶活性。然后在枸橼酸钠抗凝新鲜人全血中顺序加入 125I 纤维蛋白原、CaCl2 和人凝血酶,混合液用聚乙烯管迅速抽吸混匀,37温育 20min 在管内形成条状
8、 125I 血栓，转移至三角烧瓶用生理盐水振荡漂洗。漂洗后将 125I 血栓切成等长小条,分别测量和记录放射性。 用该法可测定肺、心等 125I 血栓存在部位的放射性，以反映该部位血栓的溶栓率,也可收集粪、尿、血,测定其放射性,反应其排泄率和回收率,该法定位、定量准确,是目前最为理想的肺栓塞方法,但是对实验室要求程度高,且 I 对纤维蛋白原的活性有一定影响,过高的放射性可使凝血块的稳定性降低。梁心平等认为将放射比活度定为 2.7810Bq/mg最为理想，在此条件下洗脱 20min,洗脱液中放射性稳定接近于零水平15。3.2 小鼠肺栓塞模型 小鼠肺栓塞的模型采用尾静脉注射含胶原 10ug 和肾上
9、腺素 5ug的混合液 100ul,引起动物死亡或麻痹,Diminno 等认为,死亡或麻痹是由于胶原和肾上腺素引起肺血小板血栓形成和血管收缩,导致呼吸阻断,大量血小板形成血栓引起循环血小板量减少,聚集的血小板进一步释放 TXA和 PGFa 加重呼吸障碍,引起动物死亡16。该模型制备方法简便,操作步骤易行性高,且费用低廉,可用于大规模样本的实验研究,尤其是药物对肺栓塞模型的影响及其保护率。 3.3 犬肺栓塞模型 犬的急性肺栓塞模型多采用体外自体血凝块,具体方法:动脉采血 60100ml(5ml/kg),加入含凝血酶的玻璃皿中,静置凝固 2h,用刀片将血栓纵横切成小块,大小约(10105)mm3,弃
10、血清后装入注射器中,反复经右颈静脉注入栓子，维持肺动脉收缩压于 5066mmHg(1mmHg=0.133kPa),一旦低于 50mmHg,再次注入栓子,过程持续 30min,其后稳定 1h。由于该法操作复杂,手术要求难度高,手术时需要颈静脉、股静脉和股动脉的插管,其中颈静脉的插管为采血和注栓用,股动脉插管用于主动脉、左室压力等功能的测定,股静脉插管用于右房、右室压及肺动脉平均压、肺毛细血管嵌压和心排血量、肺血管阻力等有心动能的测定。许俊堂等研究后认为,该模型注入栓子后肺动脉平均压和肺血管阻力可以恒定的维持在高水平达 4h 而不降低,在对该模型溶栓后肺动脉平均压和肺血管阻力 30min 后即开始
11、显著下降,符合肺栓塞患者的临床表现,是极为理想的模型,但是由于犬价格较高,而限制了它的应用17。 3.4 猪肺栓塞模型 由于猪较肥硕且成本昂贵,研究较少,故不作为研究肺栓塞的常规模型。 4 小结 综上所述，在各种肺栓塞模型中，小鼠体内血栓形成法制备肺栓塞的模型的方法最为简便，可用于大规模样本的实验研究。家兔、犬由于可测定凝血时间等，最能模拟临床的肺栓塞发作时各种生理、病理变化，且体内及体外血栓法制备均可。其中家兔和犬的体外血栓法制备模型成功率高,模型持久,是最常选用的方法。 参 考 文 献 1.王乐民.急性肺动脉栓塞:从基础到临床M.哈尔滨:黑龙江科学技术出版社,1999. 2王乐民.肺栓塞临
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