1、负压对糖尿病足犬皮肤 CGRP 免疫反应性神经纤维的影响作者：李晓军，王倩，易军，凌瑞，王岭，宁莫凡 【摘要】 目的： 观测正常犬及糖尿病足治疗前后皮肤的降钙素基因相关肽(CGRP) 能感觉神经纤维数量的变化. 方法： 犬 15 只. 随机分治疗组 5 只、非治疗组 5 只和正常对照组 5 只，治疗组和非治疗组均将动物制作左后肢糖尿病足模型, 治疗组在模型制作后 14 d，开始行患肢负压治疗 10 d (15 min/次)；非治疗组不做负压治疗. 三组均行患肢足趾皮肤免疫组化染色，检测 CGRP 免疫反应阳性纤维. 结果： 非治疗组皮肤中每 400 倍视野中 CGRP 免疫反应阳性神经纤维(5
2、3.25.6) m/mm2 较正常对照组(11.72.3) m/mm2 增多（LSDt=16.94, P0.01 ） ，治疗组(32.52.9) m/mm2 较非治疗组减少（LSDt=8.47, P0.01） ，但仍较正常对照组增多（LSDt=8.47, P0.01）. 结论： 糖尿病足发病后，远端肢体皮肤中的 CGRP 免疫反应阳性神经纤维数量明显增多，可能是机体的一种自身保护机制. 肢体负压疗法可促进感觉神经纤维中 CGRP 释放，扩张血管，可用于糖尿病足的治疗. 【关键词】 降钙素基因相关肽；糖尿病足；肢体负压 【Abstract】 AIM: To investigate the cha
3、nges of calcitonin generelated peptide (CGRP) in nerve fibers of skin in normal dogs and ones with diabetic foot before and after treatment. METHODS: Fifteen dogs were randomly divided into treatment（n=5）, nontreatment（n=5）and normal control（n=5）groups. The diabetic foot model was made at left hindl
4、imb in nontreatment and treatment groups. The treatment group was treated by negative pressure on affected limbs for 10 d (15 min/d) from the 14th day after the models were made. However, the nontreatment group was not treated. All the animals were detected for the change of CGRP immunoreactive nerv
5、e fibers in the skin of left hindlimb toes by immunohistochemistry. RESULTS: Compared with the normal control group (11.72.3) m/mm2, the CGRP immunoreactive nerve fibers in the skin of nontreatment group (53.25.6) m/mm2 were increased obviously (LSDt=16.94, P0.01). Meanwhile, the CGRP immunoreactive
6、 nerve fibers in the skin of treatment group (32.52.9) m/mm2 were decreased obviously (LSDt=8.47, P0.01) compared with the nontreatment group, but were still more than those in the normal control group(LSDt=8.47, P0.01). CONCLUSION: The number of CGRP immunoreactive nerve fibers significantly increa
7、ses in nerve fibers of skin of limb in diabetic foot. We consider that as a selfprotect mechanism in body. Negative pressure can stimulate the releasing of CGRP in the sensory nerve fibers and expand the vessels, so it can be used for the treatment of diabetic foot. 【Keywords】 calcitonin generelated
8、 peptide; diabetic foot; limb negative pressure 0 引言 糖尿病足(diabetic foot)又称糖尿病肢端坏疽，是糖尿病慢性致残性并发症. 主要病因为下肢中小血管及微循环障碍，周围神经病变并发感染所致. 其临床症状多较重，且手术及药物治疗效果不佳. 肢体负压（limb negative pressure, LNP）用以治疗肢体缺血性疾病，已取得了比较好的疗效1. 本实验我们通过对糖尿病足犬行患肢负压治疗，检测病变犬治疗前后及正常犬降钙素基因相关肽(calcitonin generelated peptide, CGRP)能皮肤感觉神经纤维数量
9、的变化，以研究糖尿病足的病理变化及从神经角度探讨肢体负压的治疗机制. 1 材料和方法 1.1 材料 健康杂种犬 15 只，由第四军医大学西京医院动物实验室提供，体质量 1218 kg，雌雄不限，动物编号后，按随机数字表法，随机分为 3 组（n=5）：治疗组，非治疗组，正常对照组. LNP 治疗机由我科自制：负压舱用长 60 cm、内径 25 cm 的密封硬塑料圆桶制成，一端开有 8 cm10 cm 椭圆形口，开口周围附一圆橡皮套，作为肢体入口；另一端开一 1 cm1 cm 小口并引出塑料管；侧壁开一小孔，安装放气阀. 负压舱经塑料管与减压吸引机相连. 犬皮肤组织冰冻切片所用的 Leitz140
10、0 滑动冰冻切片机由德国 Leitz 公司生产，Leica1800 恒冷箱切片机由德国Leica 公司生产. 观察免疫组化切片所用的 Quantimet570 图像分析仪由德国 Leica 公司生产. 抗CGRP （一抗）血清由新西兰 Watpa 公司生产，兔抗 BigG（二抗） 、ABC 复合物溶液、DAB 试剂、葡萄糖氧化酶试剂、TrixonX100 溶液由美国 Sigma 公司生产，硫酸镍铵试剂由西安化学试剂厂提供，中性树胶溶液（进口分装）由上海试剂公司提供. 1.2 方法 1.2.1 动物分组和模型的建立 治疗组：将动物制作左后肢糖尿病足模型, 制作后 14 d 开始行LNP 治疗.
11、于 LNP 治疗 10 d 后, 行动物灌注，分别切取患肢第 2 足趾皮肤，行免疫组化染色，检测 CGRP 免疫反应阳性神经纤维. 非治疗组：除不进行 LNP 治疗外，处理、检查均同治疗组. 正常对照组： 不行缺血模型制作及负压治疗, 仅行免疫组化染色检测. 按李建水等2报道手术切除动物全胰腺组织，制造型糖尿病动物模型，并行一侧肢体股动脉内置入螺旋状金属丝一根以形成该侧肢体缺血状态3 ，模拟建立犬后肢糖尿病足动物模型. LNP 治疗：动物浅麻醉后，左后肢根部环形脱毛，将左后肢置入自制负压舱中，压力为12 kPa，持续 15 min，1次/d，连续 10 d. 1.2.2 免疫组化染色分别将切取
12、的患肢第 2 足趾皮肤，放入 40 g/L多聚甲醛中，固定 4 h，后投入 200 g/L 蔗糖液中过夜. 组织切成片厚15 m 的切片. 经 0.01 mol/L KPBS（pH=7.4）洗涤 5 min3, 3 mL/L TritonX100 30 min, 0.01 mol /L KPBS 洗涤 5 min3，然后入一抗，将切片入兔抗SP 血清（15000） ，在 4孵育 48 h，经洗涤后依次入二抗（1500）和 ABC（1500）各 3 h（室温） ，经 DAB 硫酸葡萄糖氧化酶反应，待切片干燥后，经乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片. 统计学处理：用 Quantimet 570（L
13、eica）图像分析仪观察免疫组化切片，每张切片观察 5 个视野（放大倍数400） ，测量足趾皮肤单位面积的免疫阳性神经纤维的长度. 数据以 xs 表示，经 SPSS 11.0 统计软件处理，多组间比较采用方差分析，两两比较用 LSDt 检验. 2 结果 正常对照组趾皮的角质层中, 未见有 CGRP 免疫反应阳性纤维. 在真皮层中的小血管周围和结缔组织之间，可见有少量 CGRP 免疫反应阳性神经纤维（图 1）. 非治疗组 CGRP 神经纤维明显较对照组增加（P0.01） ，染色加深（图 2）. 治疗组 CGRP 神经纤维（图 3）均较非治疗组减少（(32.52.9) vs (53.25.6) m
14、/mm2LSDt=8.47, P0.01） ，但仍较正常对照组增多(11.72.3) m/mm2, LSDt=8.47, P0.01. 3 讨论 糖尿病足临床以肢体疼痛、溃疡及坏疽为特征，晚期常因下肢坏疽而截肢4. 导致坏疽发生的主要因素是糖尿病晚期病变：多发性神经病变（PNP）和周围动脉闭塞性疾病（PAOD）. 糖尿病足可行手术及药物治疗，但其治疗效果多不佳. LNP 属于局部负压治疗的一种，它在治疗高血压、血栓闭塞性脉管炎、动脉硬化性闭塞症及雷诺综合征等疾病方面取得良好的疗效1. 其安全、简便、无副作用、效果良好. 我们曾从血液流变学、血液动力学、微循环、神经递质等各方面就负压治疗从机制上
15、进行了探讨5-6. 实验证明 LNP 对缺血肢体血管和神经均有不同程度的影响. CGRP 广泛分布于中枢和外周神经系统，具有非常广泛的生物学效应7-8 ，特别是对心血管系统，具有强心、扩血管作用，是迄今为止发现的最强大的内源性血管舒张物质. CGRP 除可促进血管的扩张外，还可对防止血管损伤具有一定的保护作用9. 本实验中正常对照组趾皮的角质层中, 未见有 CGRP 免疫反应阳性纤维. 在真皮层中的小血管周围和结缔组织之间，仍可见有少量 CGRP 免疫反应阳性神经纤维. 分布于皮肤小血管周围的 CGRP 免疫反应阳性神经纤维可以释放 CGRP 进入血液刺激血管内皮细胞释放 NO, 舒张血管平滑
16、肌，扩张血管, 提高血流量. 糖尿病足患者常出现患肢缺血和疼痛，患肢的缺血不仅造成肢体组织的营养不良，还可引起组织代谢产物的积聚，造成局部组织液的酸性化和组织的慢性炎症. 有报道显示, 皮肤组织的炎症可以使皮肤组织中神经营养因子（NGF）的含量增加10. 在腰段的背根神经节中, CGRP 免疫反应阳性神经元为 NGF 受体阳性11. NGF 可促使皮肤中CGRP 免疫反应阳性神经纤维的生长和神经元中 CGRP 含量的增加12. 本结果显示，未经 LNP 治疗的非治疗组与正常对照组相比，其远端肢体皮肤中的 CGRP 免疫反应阳性神经纤维不仅数量多，而且染色也深. 这可能与糖尿病足犬远端肢体组织中
17、 NGF 的含量增加有关，或者是病变犬的一种自身代偿反应. 经 LNP 治疗后，糖尿病足犬皮肤的 CGRP 免疫反应阳性神经纤维较非治疗组明显减少（P0.01）. 我们认为是 LNP 促进了皮肤中的 CGRP免疫反应阳性神经纤维中的 CGRP 释放. CGRP 释放入血后，可以促进血管的扩张，改善神经功能障碍，对神经细胞损伤，发挥其保护作用10 ，并对神经痛，有良好的止痛效果11. 这可能是肢体负压可以改善患肢血液循环、减轻疼痛、取得良好治疗效果的一个原因. LNP 治疗后，肢体远端皮肤中的 CGRP 免疫反应阳性神经纤维减少的原因，可能由于: 肢体负压可促进感觉神经末梢对 CGRP 的释放，
18、造成神经末梢中 CGRP的含量减少，从而使经免疫组织化学方法染色后的阳性神经纤维减少； 肢体负压可增加缺血组织的血液灌流1 ，使皮肤营养状况改善及炎症反应减轻，导致皮肤中 NGF 量下降，从而 CGRP 免疫阳性神经纤维生长受到抑制. 但由于没能达到正常时的血液灌注水平，因而皮肤中的 CGRP免疫阳性神经纤维仍然要较正常为多. 【参考文献】 1宁莫凡，马中，杨振东，等. 负压疗法治疗肢体缺血J 第四军医大学学报，1998,19（4）:424-425. 2李建水，张肇达，唐勇，等新型同种异体猪全胰十二指肠移植模型的建立与评价J. 中华实验外科杂志，2004,21(5):559-560. 3边杰芳
19、，杨振东，宁莫凡，等犬后肢动脉闭塞性病变模型的建立J 中华实验外科杂志，1996,13(6):325. 4常宝成，潘从清. 糖尿病足的诊断和治疗J 国外医学内分泌学分册，2002,1:25-28. 5姚青，宁莫凡. 肢体负压对犬肢体动脉闭塞性病变血液流变学的影响J 中国现代医学杂志，2003,13（21）:108-109. 6马中，宁莫凡，严立军，等. 肢体负压抗缺血肢体的自由基损伤J 第四军医大学学报，1996,17（4）:303. 7朱锦宇，朱庆生，黄耀添. 周围神经损伤晚期修复后脊髓后角 P 物质和降钙素基因相关肽变化的定量研究J 中国临床康复，2002,6（22）:3332-3333.
20、 8钟广伟，李炜，邓干初，等. 针刺对偏头痛大鼠脑内降钙素基因相关肽基因表达的影响J. 中国临床康复，2002,6（24）:3680-3681. 9陈玉华，苏健民，武革，等. 内皮素、降钙素基因相关肽参与糖尿病合并脑梗死发病过程中的作用J 中国临床康复，2003,7（15）:2141-2143. 10Donnerer J, Schuligoi R, Stein C. Increase content and transport of substance P and calcitonin generelated peptide in sensory nerves innervating infl
21、amed tissue: Evidence for a regulatory function of nerve growth factor in vivoJ. Neuroscience, 1992, 49(3): 693-698. 11Snider WD, Mcmahon SB. Tackling pain at the source: New ideas about nociceptorsJ. Neuron, 1998, 20(4): 629-632. 12Koltzenburg M, Handwerker HO. Differential ability of human cutaneous nociceptors to singal mechanical pain and to produce vasodiatationJ. J Neurosci, 1994, 14(3): 1756-1765.
