1、腹腔注射内毒素对老年大鼠记忆保持功能的损害【摘要】 目的 探讨腹腔注射内毒素(LPS)对成年和老年大鼠记忆保持功能的影响。方法 按照析因设计的方法，将成年和老年雄性 SD 大鼠各 32 只随机分为 4 组：成年大鼠/生理盐水组(C 组)、成年大鼠/LPS 组(L 组)、老年大鼠/生理盐水组(A 组)和老年大鼠/LPS 组(A+L 组)，每组16 只，然后每组随机取 8 只大鼠分别进行 Morris 水迷宫和 Y 迷宫训练，经训练获得记忆后 24 h 腹腔注射 LPS250 g /kg 或等体积的生理盐水。给药后 24 h 进行记忆保持功能测试，水迷宫测试以达到平台前的游泳距离和 Y 迷宫测试以
2、大鼠受到连续 20 次电击后进入安全区的正确反应次数作为观察指标，测试结束后立即取海马组织用酶联免疫吸附试验测定白细胞介素1(IL1) 蛋白的表达。结果 年龄与 LPS 对大鼠到达平台前的游泳距离和受电刺激后正确反应次数的影响，各自的主效应有统计学意义(P0.05，P0.01)，而交互作用无统计学意义(P0.05);组间比较表明，A+L 组较 A 组和 L 组大鼠到达平台前的游泳距离延长和受电刺激后正确反应次数减少，差异具有统计学意义(P0.05)，而 L 组与 C 组和 A 组与 C 组的差异无统计学意义(P0.05)。年龄和 LPS 对海马 IL1 蛋白表达的影响，各自的主效应有统计学意义
3、(P0.01)，且两者间的交互作用也具有统计学意义(P0.01)，组间比较表明，L 组大鼠海马 IL1 蛋白表达高于 C 组，差异有统计意义(P0.05)，A 组与 C 组差异无统计学意义(P0.05)，A+L 组大鼠海马 IL1 蛋白表达高于 A 组和 L 组，差异具有统计学意义(P0.01)。结论 腹腔注射 LPS 后老年大鼠记忆保持功能受损，而不影响成年大鼠的记忆保持功能，这与衰老加重 LPS 诱导的海马 IL1蛋白表达升高有关。 【关键词】 记忆保持;内毒素(LPS);老年;白细胞介素1(IL1);海马外周免疫系统受到感染等刺激后，促炎细胞因子释放增加，激活免疫神经传导通路，导致中枢神
4、经系统促炎细胞因子和外周一样表达增加，机体出现记忆功能减退1 。研究表明，外周免疫激活后中枢促炎细胞因子的表达随着机体的衰老过程而改变，老年比成年机体增加更明显2 ，但外周免疫激活对成年和老年机体的记忆功能是否产生不同的影响还未见报道。我们应用腹腔注射内毒素(LPS)来模拟急性外周感染，刺激成年和老年大鼠的外周免疫系统，来研究外周免疫激活对成年和老年大鼠记忆保持功能的影响。1 材料与方法1.1 动物 3 月龄和 18 月龄雄性 SD 大鼠(东南大学实验动物中心提供)，体重分别为 250350 g 和 650750 g，饲养在温度 24 、湿度50%和明暗交替各 12 h 的环境中，自由进食和饮
5、水。1.2 试剂与仪器 LPS(血清型 055:B5 Sigma)，大鼠白细胞介素1(IL1)ELISA 试剂盒购于上海西唐生物科技有限公司，酶标仪(芬兰 Thermo 公司)，Morris 水迷宫视野分析系统和 Y 迷宫分别由上海吉量软件科技有限公司和张家港生物医学仪器厂提供。1.3 方法1.3.1 动物分组与给药 将成年和老年大鼠各 32 只随机分为 4 组：成年大鼠/生理盐水组(C 组)、成年大鼠/LPS 组(L 组)、老年大鼠/生理盐水组(A 组)和老年大鼠/LPS 组(A+L 组)，每组 16 只。然后每组随机取 8只大鼠分别进行 Y 迷宫和水迷宫训练，整个训练结束 24 h 后腹腔
6、注射LPS 250 g /kg 或等体积的生理盐水。1.3.2 Y 迷宫测试 将大鼠放入迷宫中适应 5 min 后，以所在的支臂为起始区给予电击(电压 4050 V)，大鼠受到电刺激后逃至安全区，灯光继续作用 10 s，然后继续以所在的支臂作为下一次测试的起点进行第 2 次测试，依次重复，以无规则次序变换安全区，每天固定训练 20 次。大鼠足底通电后 10 s 内一次性跑向安全区为正确反应，当连续 20 次测试中有 18 次或以上正确反应时，表示达到学会标准，训练过程结束，记录大鼠达到学会标准所用的天数。腹腔给药 24 h 后，按照训练时的方法进行测试，以大鼠受到连续 20 次电击后进入安全区
7、的正确反应次数作为记忆保持成绩。1.3.3 Morris 水迷宫测试 将水迷宫平分为 4 个象限，放置一圆形平台固定于某一象限中央，平台顶低于水面 1 cm，迷宫上方安装有摄像机记录大鼠的运动轨迹，测试期间保持外参照物不变。大鼠先进行 7 d的定位航行训练，每天进行 4 次，每次间隔 1 min，大鼠随机从不同的象限入水点出发，大鼠找到平台后停留 30 s，应用水迷宫视频分析系统进行处理，记录大鼠到达平台前的游泳距离，取 4 次测试的平均值作为每日的训练成绩，如在 60 s 内仍未找到，则将其引导至平台停留 30 s，并记录 60 s 内的游泳距离，另外在训练期间记录大鼠的游泳速度。同样在腹腔
8、给药 24 h 后，按照训练时的方法进行测试，记录大鼠到达平台前的游泳距离作为记忆保持成绩。1.3.4 海马组织 IL1 蛋白测定 应用酶联免疫吸附试验法行蛋白测定，记忆保持测试结束后立即断头处死大鼠，暴露颅腔迅速分离出两侧海马组织，先进行组织蛋白提取，将海马组织按 50 mg/ml 的比例加入组织裂解液，于冰浴上制作组织匀浆，4 12 000 r/min 离心 15 min 后将上清转移到 1.5 ml 离心管里-70 冰箱中保存。测定时取组织蛋白提取液 100 l，加至 IL1 单抗包被的 96 孔板中，37 孵育 2 h，充分洗板后，加入生物素化的 IL1 单抗，37 孵育 1 h，洗板
9、后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素，置 37 温箱 30 min，洗板后加入底物 37 反应 15 min，最后加入终止液，在 450 nm 处测定 OD 值，根据标准曲线得出 IL1 含量，然后除以用 Bradford 法测定得到的提取液总蛋白浓度，作为海马组织 IL1 蛋白表达量。1.3.5 统计学处理 实验数据以 xs 表示，应用 SPSS13.0 进行统计学分析，Y 迷宫训练所观察指标的比较采用 t 检验，水迷宫训练所观察指标的比较采用重复测量资料方差分析(组间因素为年龄，组内因素为时间)，记忆保持测试成绩和海马组织 IL1 蛋白表达采用两因素的方差分析(一因素为年龄，另一因素为 LPS
10、)，当两因素具有交互作用或各自主效应有统计学意义时，应用 StudentNewmanKeuls 法进行组间两两比较。2 结 果2.1 Y 迷宫测试 老年大鼠达到学会标准的时间(8.91.7)d 较成年大鼠(5.11.0)d 延长，差异有统计学意义(P0.01)。记忆保持测试中，年龄与 LPS 对大鼠受电刺激后正确反应次数的影响，各自的主效应有统计学意义(P0.05)，而交互作用无统计学意义(P0.05)，组间比较表明，A+L 组较 A 组和 L 组大鼠受电刺激后正确反应次数减少，差异具有统计学意义(P0.05)，而 L 组与 C 组和 A 组与 C 组的差异无统计学意义(P0.05)(见表 1
11、)。2.2 Morris 水迷宫测试 年龄和时间对大鼠 7 d 训练中到达平台前的游泳距离的影响具有统计学意义(P0.05)，而两者间的交互作用无统计学意义(P0.05)，训练每个时间点的组间比较，第 1 5 d 老年较成年大鼠游泳距离长，差异有统计学意义(P0.05,P0.01)，而第 6 和 7 天两者间差异无统计学意义(P0.05)(见表 2);年龄对大鼠训练中游泳速度的影响具有统计学意义(P0.05 或 P0.01)，而时间的影响及年龄和时间的交互作用无统计学意义(P0.05)，训练每个时间点的组间比较，整个训练过程老年较成年大鼠游泳速度慢，差异有统计学意义(P0.05)(见表 2)。
12、记忆保持测试中，年龄与 LPS 对大鼠到达平台游泳距离的影响，各自的主效应有统计学意义(P0.01,P0.05)，而交互作用无统计学意义(P0.05)，组间比较表明，A+L 组较 A 组和 L 组到达平台前的游泳距离延长，差异具有统计学意义(P0.05)，而与 C 组比较，L 组和 A 组均无显著性变化(P0.05)(见表 2)。 表 1 腹腔注射内毒素对成年和老年大鼠记忆保持功能2.3 海马 IL1 蛋白表达 年龄和 LPS 对海马 IL1 蛋白表达的影响，各自的主效应有统计学意义(P0.01)，且两者间的交互作用也具有统计学意义(P0.01)。组间比较表明，L 组大鼠海马 IL1蛋白表达高
13、于 C 组，差异有统计意义(P0.05)，A 组与 C 组差异无统计学意义(P0.05)，A+L 组大鼠海马 IL1 蛋白表达高于 A 组和 L组，差异有统计学意义(P0.01)(见表 1)。表 2 成年和老年大鼠 7 d水迷宫训练中到达平台前的游泳距离和速度与成年大鼠比较：1)P0.05，2)P0.013 讨 论本研究表明，腹腔注射 LPS 后老年大鼠记忆保持功能受损，而不影响成年大鼠的记忆保持功能，这与衰老加重 LPS 诱导的海马 IL1蛋白表达升高有关。Morris 水迷宫和 Y 迷宫训练阶段，老年大鼠表现出较成年大鼠减退的学习记忆功能3 ，但经过一段时间的训练后，老年与成年大鼠一样能够
14、达到 Y 迷宫测试的学会标准，并且与成年大鼠到达平台前的游泳距离没有差别。大鼠获得相应记忆功能后，经腹腔注射 LPS 损害了老年大鼠的记忆保持功能，而对成年大鼠没有影响。在水迷宫测试中，我们没有选择常用的到达平台前的潜伏期作为观察指标，这是因为腹腔注射 LPS 后可致大鼠的运动速度减慢4 ，如选择潜伏期作为学习记忆指标，易夸大 LPS 的效应，因此在本研究中选择游泳距离作为大鼠的学习记忆成绩。外周促炎细胞因子释放增加，激活免疫神经传导通路，致使中枢神经系统胶质细胞活化5 ，促炎细胞因子表达增加，与海马区细胞因子受体结合后抑制长时程增强和损害学习记忆功能，在外周免疫激活诱导的记忆障碍中，海马组织
15、 IL1 表达增加起着重要作用6 。在中枢神经系统，衰老过程中胶质细胞呈现出激活状态的表型特征，例如，小胶质细胞补体 iC3b 受体(CD11b)、主要组织相容性复合体(MHC )和星形胶质细胞酸性纤维蛋白(GFAP)表达增加7，8 ，体外培养的老年大鼠中枢胶质细胞受到 LPS 刺激后，促炎细胞因子水平高于成年大鼠9 ，上述的原因可解释本研究中年龄和 LPS 对 IL1 表达的影响具有的交互作用，老年和成年大鼠 IL1 基础表达水平没有差别，但腹腔注射 LPS 后，老年大鼠海马 IL1 表达升高比成年大鼠更明显，因此衰老加重了 LPS 诱导的海马 IL1 表达升高。成年大鼠应用 LPS 后海马
16、 IL1 表达升高，尽管有统计学意义，但只升高 1 倍，可能尚不能影响记忆保持功能，这与本研究中应用 LPS 剂量较小有关，在 Jain 等10的研究中 LPS 用量达 2 mg/kg，削弱了成年大鼠的记忆功能。在临床上，老年患者外周感染后出现急性认知功能障碍(记忆保持是认知功能的一部分)11 ，也验证了本研究的结果，如何减轻老年患者感染后的认知功能减退值得进一步的研究。【参考文献】1 Maier SF，Watkins LR.Immunetocentral nervous system communication and its role in modulating pain and cogn
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