1、腹透液相关浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞周期蛋白的影响及葛根素的拮抗作用【摘要】 目的 研究腹透液相关浓度葡萄糖（1.5、2.5）对人腹膜间皮细胞周期和周期蛋白 p21 的影响及葛根素的拮抗作用。方法 人腹膜间皮细胞在含糖（1.5、2.5） 、含糖含葛根素(葛根素终浓度为 100 mg/L)的无血清培养基中培养 24 h 后,用流式细胞仪分析细胞周期,Western blot 测定 p21 蛋白的表达。结果 经含糖 1.5和含糖 2.5培养基培养 24 h 后人腹膜间皮细胞大多出现肥大和停滞于细胞周期的 G1期。高浓度葡萄糖刺激 p21 蛋白表达,含糖 2.5组和含糖 1.5组无显著性差异(P0.
2、05)。含葛根素含糖组腹膜间皮细胞中处于 G1 期细胞数较相应浓度含糖组减少，p21 表达减少(P0.05)。结论 高糖可刺激人腹膜间皮细胞 p21 蛋白的表达,且可能与高糖作用下细胞肥大及 G1 期阻滞有关，葛根素可在一定程度上拮抗高糖对人腹膜间皮细胞周期和周期蛋白的影响。 【关键词】 腹膜间皮细胞;葡萄糖;细胞周期蛋白；葛根素 Abstract: Objective To investigate the effect of glucose at different concentrations on the cell cycle and p21 expression in cultured
3、 human peritoneal mesothelial cells (HPMC) and protection of puerarin. Methods HPMCs were cultured with serum free RPMI 1640 medium containing glucose of different concentrations (1.5% and 2.5%) and puerarin (100 mg/L) for 24 hours. The cell cycle distribution was then investigated by flow cytometry
4、. The expression of p21 was detected by Western blot. Results In the presence of 1.5% and 2.5% glucose concentrations, most of the cells became hypertrophic, and were arrested in G1 phase of cell cycle. High glucose stimulated expression of p21, which had no difference between the 1.5% and 2.5% (P0.
5、05). The number of the cells arrested in G1 and p21 expressions decreased in groups of puerarin. Conclusion High glucose stimulated the expression of p21, which might be related to the hypertrophy and arrest in the G1 phase of mesothelial cells by high glucose. Puerarin might antagonize the effect o
6、f high glucose of the cycles of mesothelial cells and their cyclin. Key words: peritoneal mesothelial cells; glucose; cyclin; puerarin 腹膜纤维化所致的腹膜功能衰竭是腹膜透析应用受限的主要原因。研究发现高糖可使间皮细胞肥大,间皮细胞层受损或缺失,导致腹膜纤维化和功能丧失1,有效保护腹膜间皮细胞能延缓腹膜纤维化。细胞周期调控蛋白 p21 过度表达与细胞肥大有关2-3 。葛根素能拮抗腹膜透析液对腹膜间皮细胞的损伤,发挥抗纤维化作用4 。本实验观察高浓度葡萄糖对人腹膜
7、间皮细胞周期和 p21 蛋白的影响及葛根素的拮抗作用,从细胞周期和周期蛋白角度探讨葛根素抗腹膜纤维化的分子机制。 1 材料和方法 1.1 材料 含糖腹膜透析液购于广州百特公司,葛根素为浙江康恩贝制药股份公司产品,血清、RPMI1640 粉剂、胰酶购自 GBCO 公司,抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、抗第八因子抗体和抗白细胞 CD45 抗体、抗 p21 抗体购自北京中山生物技术有限公司,流式细胞仪为 Becton Dickinson 公司产品。 1.2 方法 1.2.1 人腹膜间皮细胞的分离、培养与鉴定 取非尿毒症和糖尿病择期手术患者的网膜作为细胞来源,按文献5法培养间皮细胞。当细胞生长融合时
8、用胰酶消化,按 13 传代,第 3 代用于实验。经倒置显微镜观察和免疫组化抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体染色阳性,抗第八因子抗体和抗白细胞 CD45 抗体染色阴性鉴定。 1.2.2 间皮细胞分组及在不同条件下的形态观察 将融合后的腹膜间皮细胞消化后接种于 6 孔培养板中,培养至亚融合后加入无血清RPMI1640 培养基,同步化培养 24 h 后分别加入含不同浓度葡萄糖（1.5%、2.5%）和（或）葛根素(葛根素终浓度为 100 mg/L)的培养基中培养 24 h，在倒置显微镜下观察细胞形态。实验分对照组（不含糖不含葛根素） 、含糖 1.5组、含糖 2.5组及葛根素组、含葛根素含糖 1.5组、
9、含葛根素含糖 2.5组 6 组。 1.2.3 流式细胞仪分析各组间皮细胞的周期分布 腹膜间皮细胞在不同条件培养基中培养 24 h 后用 PBS 液洗 2 次，胰酶消化，70%乙醇固定后，重悬于 PBS 液中。加入 RNA 酶 50 mg/L,避光 30 min 离心去上清液。碘化吡啶于暗处染色 30 min 后，用流式细胞仪检测，得到细胞周期各时相百分比。 1.2.4 Western blot 检测不同浓度葡萄糖及葛根素作用下间皮细胞的周期蛋白 用 RAPA 裂解液提取细胞总蛋白，取 40 g 样品经煮沸 5 min 后进行 10%、15%的 SDS-PAGE 电泳，采用电转印法将凝胶上的蛋白
10、转移至硝酸纤维素膜，膜在室温封闭 4 h，加 1100 抗 p21 抗体，4过夜，后加二抗室温作用 1 h，洗膜后显色。 1.3 统计学处理 数据采用s 表示，用 SPSS 120 统计软件对所得数据进行分析，各组腹膜间皮细胞 p21 表达的比较采用单因素方差分析，P0.05 表示存在显著性差异。 2 结 果 2.1 各组人腹膜间皮细胞周期的比较 对照组培养 24 h 的间皮细胞中 G1 期细胞比例为（62.53.3）%,而含糖 1.5组和含糖 2.5组 G1期细胞比例增高,分别为（72.13.54）%和（72.53.4）%，与对照组有显著性差异(P0.05)，含糖 2.5组和含糖 1.5组无
11、显著性差异（P0.05） 。含葛根素含糖 1.5组和含葛根素含糖 2.5组 G1 期细胞比例分别为（64.74.5）%和（65.64.3）%,与对照组之间无显著性差异（P0.05） 。 2.2 各组人腹膜间皮细胞 p21 的表达 图 1 可见，对照组腹膜间皮细胞 p21 表达少,含糖 1.5组和含糖 2.5组与对照组比较 p21 表达增多（P0.05）,其中含糖 2.5组与含糖 1.5组无显著性差异（P0.05） 。含葛根素含糖组较相应浓度含糖组 p21 表达减少（P0.05） 。 3 讨 论 腹膜透析作为有效的肾脏替代治疗方法已经被越来越多的尿毒症患者所接受,腹膜发生纤维化导致腹膜功能衰竭是
12、患者退出治疗的主要原因之一。含糖的腹膜透析液具有明显的生物不相容性,其导致腹膜间皮细胞损伤被认为是腹膜纤维化的关键因素6 。有效保护腹膜间皮细胞可明显延缓腹膜纤维化的进程。 在长期腹膜透析过程中腹膜间皮细胞可因持续暴露于高糖腹膜透析液中而出现细胞肥大、细胞分裂停滞等表现。在本实验中我们也发现高浓度葡萄糖促使间皮细胞停滞于细胞周期的 G1 期。目前认为细胞肥大可能是由于细胞受细胞内外信号刺激后进入 G1 期时,DNA 合成被抑制，同时蛋白和 RNA 合成增加,细胞生长停滞于 G1 期所致7 。细胞周期抑制蛋白 p21 能广泛抑制 G1 期和 S 期的周期素与细胞周期激酶结合,使 G1 期过度延长
13、,细胞增殖抑制,细胞呈肥大状态。 研究表明葛根素可以通过抑制氧化应激对腹膜间皮细胞产生保护作用4 ，但葛根素可否拮抗高糖对人腹膜间皮细胞周期和周期蛋白的影响尚不明确。我们检测不同浓度葡萄糖对腹膜间皮细胞 p21 表达的影响,发现高浓度葡萄糖可刺激腹膜间皮细胞 p21 的表达，而含糖含葛根素组细胞较相应浓度含糖组 p21 表达减少。本研究提示高糖状态下间皮细胞形态学的改变可能与细胞周期的调控失衡有关，葛根素可拮抗上述影响，此结果为葛根素抗腹膜纤维化的分子机制提供理论依据。 综上所述，高糖可使腹膜间皮细胞停滞于 G1 期，可刺激腹膜间皮细胞 p21 蛋白的表达,葛根素可在一定程度上拮抗高糖对间皮细
14、胞周期和周期蛋白的影响。由此推测,葛根素可能通过拮抗高糖对间皮细胞周期和周期蛋白的影响而保护腹膜间皮细胞,从而发挥抗腹膜纤维化的作用。 【参考文献】 1 Gotloib L, Shostak A, Wajsbrot V, et al. High glucose induced a hypertrophic, senescent mesothelial cell phenotype after long in vivo exposure J. Nephron,1999,82(2):164-173. 2 Shankland SJ. Cell cycle control and renal dise
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