1、钙调神经磷酸酶在醛固酮致心肌成纤维细胞增殖中的作用作者：张冀东，崔炜，王永利，张海林，武宇洲，鲁静朝，杨晓红，都军，刘凡，谢瑞芹 【摘要】 目的： 检测醛固酮(Ald)诱导的心肌成纤维细胞（CFs）增殖中钙调神经磷酸酶（CaN）mRNA，蛋白表达及螺内酯(Spi)，环孢素 A（CsA）对其表达的影响，从而探讨 CaN 在 Ald 致心肌纤维化中的作用. 方法： 本研究以体外培养的新生 SD 大鼠 CFs 为研究对象，以Ald 诱导其增殖和胶原合成，并加入 CsA， Spi 干预，应用 RT PCR 和Western Blot 分别测定 CaN mRNA 和蛋白表达的变化. 结果： 与对照组相比
2、，Ald 组促进 CFs 增殖和增加羟脯氨酸含量（P0.05)，与 Ald 组相比，Ald+CsA 组，Ald+Spi 组则可以明显抑制 CFs 增殖和减少羟脯氨酸含量（P0.05） ；与对照组相比，Ald 组 CaN mRNA 和蛋白表达呈浓度依赖性升高（P0.05） ，与 Ald 组比较，Ald+CsA 组，Ald+Spi 组的 CaN mRNA，蛋白表达均降低（P0.05）. 结论： 外源性 Ald 可通过 CaN依赖的信号转导通路诱导心肌纤维化，其作用与 Ald 的基因组通路有关. 【关键词】 钙神经素；醛固酮；心肌；成纤维细胞；螺内酯；环孢菌素 【Abstract】 AIM: To
3、investigate the role of calcineurin (CaN) in aldosterone (Ald)induced proliferation of cardiac fibroblasts (CFs) by testing the expressions of CaN mRNA and protein and to explore the effects of spironolactone (Spi) and cyclosporine A (CsA) on CaN expression. METHODS: In the cultured CFs of neonatal
4、SD rat, the effects of Ald, Spi and CsA on proliferation were measured by MTT colorimetric assay, synthesis of collagen was observed by determining the hydroxyproline concentration, and CaN mRNA and protein were tested by RTPCR and Western Blot, respectively. RESULTS: Compared with the control group
5、, the proliferation of the fibroblasts and the hydroxyproline concentration were significantly increased in Ald group (P0.05). Compared with Ald group, the proliferation of the fibroblasts and hydroxyproline concentration were significantly inhibited in Ald+Spi group and Ald+CsA group, respectively
6、(P0.05). Compared with the control group, CaN mRNA and protein were upregulated in Ald group (P0.05), but the increased expressions of CaN mRNA and protein were inhibited in Ald+CsA group and Ald+Spi group respectively (P0.05). CONCLUSION: Exogenous Ald can stimulate CFs proliferation and collagen s
7、ynthesis through a CaNdependent signal pathway. The effects of Ald are realized in agenomic way. 【Keywords】calcineurin; aldosterone; myocardium; fibroblasts; spironolactone; cyclosporine 0 引言 CaN 在心肌细胞肥大中起重要作用1. 目前，有关 CaN 的研究大都集中在心肌细胞肥大上，在心肌纤维化上的研究很少. 我们以前的研究表明，Ald 能剂量依赖性降低 CFs 的 iNOSNO 系统活性，促进 CFs
8、增殖，Spi 能逆转此作用1. 为了探讨 CaN 是否参与了 Ald 诱导 CFs 增殖的作用，本研究以体外培养的新生 SD 大鼠 CFs 为研究对象，以 Ald 诱导其增殖和胶原合成，并加入 Spi 和 CaN 特异性抑制剂环孢霉素A（CsA）干预后，观察 CaN mRNA 和蛋白的表达变化，从而深入了解 Ald致心肌纤维化的机制. 1 材料和方法 1.1 材料 出生 13 d 的 SD 大鼠,由河北医科大学实验动物中心提供；DMEMF12 培养液为美国 GIBCO 公司产品；胰蛋白酶, MTT, DMSO, Ald, Spi, CsA 为美国 Sigma 公司产品；胎牛血清购于兰州民海生物
9、公司；羟脯氨酸试剂盒购于南京建成生物公司；大鼠波形蛋白 mAb,羊抗鼠 CaN 抗体、HRP 标记二抗为美国 Santa Cruz 生物公司；Trizol 为美国Invitrogen 生物公司；RT Reagents, PCR Reagents, DNA Marker 为日本 TaKaRa 生物公司. 1.2 方法 1.2.1CFs 培养及鉴定 取 13 d 龄的 SD 大鼠，无菌开胸，剪取心室，用 DHanks 液清洗，剪碎. 用 1.25 g/L 胰蛋白酶+ 0.1 g/L EDTA 消化液反复消化后，分别收集各次消化细胞悬液，加入 100 mL/L 胎牛血清的 DMEMF12 培养基，离
10、心，弃上清液，加 100 mL/L 胎牛血清的 DMEMF12 培养基，制成细胞悬液，接种培养瓶中，置 37, 50 mL/L CO2 培养箱内培养. 根据 CFs比心肌细胞贴壁速度快，差速贴壁 60 min，倾去上层未贴壁细胞，剩余的即为 CFs. 加入 100 mL/L 胎牛血清的 DMEMF12 培养液继续培养. 经倒置显微镜、免疫组化波形蛋白 mAb 阳性鉴定为所需要的 CFs，细胞纯度达 96%. 待 CFs 生长接近融合时以 13 传代，实验用 34 代细胞. 1.2.2 实验分组 实验分 6 组: 10 mL/L 胎牛血清的 DMEMF12 培养液为空白对照组，110-7 mol
11、/L Ald 组，110-8 mol/L Ald 组，110-9 mol/L Ald 组，110-7 mol/L Ald+110-8 mol/L Spi 组，110-7 mol/L Ald +110-7 mol/L CsA 组. 1.2.3MTT 法测定 细胞增殖取对数生长期 CFs 5107/L 接种于 96 孔板中，37， 50 mL/L CO2 及饱和湿度下培养 24 h 后换无血清培养基，继续培养 24 h 后，使细胞进入生长静止期. 吸弃各孔培养基, 分别加不同浓度的药物，继续培养 72 h. MTT 法检测各组 CFs 的增殖，在酶联免疫检测仪上 490 nm处测定 A 值. 1.
12、2.4 羟脯氨酸测定 取对数生长期 CFs 5108/L 接种于 24 孔板中， 37， 50 mL/L CO2 及饱和湿度下培养 24 h 后换无血清培养基，继续培养 24 h 后，使细胞进入生长静止期. 吸弃各孔培养基, 分别加不同浓度的药物，继续培养 72 h. 操作步骤按羟脯氨酸试剂盒说明进行. 1.2.5RTPCR 测定 CaN mRNA 的表达取对数生长期 CFs 5109/L 接种于 50 mL 培养瓶中，37， 50 mL/L CO2 及饱和湿度下培养 24 h 后换无血清培养基，继续培养 24 h 后，使细胞进入生长静止期. 吸弃培养基, 分别加不同浓度的药物，继续培养 72
13、 h. 按照 Trizol 试剂的说明提取出总 RNA. 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳法鉴定 RNA 的完整性，紫外光分光光度计测定 RNA 的A260/A280 鉴定 RNA 的纯度. 取合乎要求的总 RNA 1 g，先逆转录合成 cDNA，再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增. 引物由北京塞百盛基因技术有限公司合成. CaN 引物(244 bp) ：上游引物 5ACT GGC ATG CTC CCC AGC GGA3 ，下游引物 5GTG CCG TTA GTC TCT GAG GCG3. 内参照为 肌动蛋白(587 bp) ：上游 5CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA
14、TGA C3 ，下游 5AGG GTA CAT GGT GGT GGC GCC AGA C3. CaN 的 PCR 反应条件: 94 2 min， （94 30 s，60 30 s，72 60 s）/30 个循环，延伸 72 10 min. 肌动蛋白的反应条件：94 2 min， （94 30 s, 58 50 s，72 90 s）/30 个循环，延伸 72 10 min. 反应结束后，取 PCR 产物 6 L，在 10 g/L 琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像系统分析，以相应的内参电泳条带作为参照，结果以两者之积分 A 的比值表示. 1.2.6Western Blot 测定 CaN 蛋白的表达细
15、胞培养和药物干预步骤同上. 细胞离心收集，用细胞裂解液裂解后加入等体积的 2SDS 上样缓冲液，取上清液于 100煮沸 5 min，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样 50 g 总蛋白. 利用水浴式电印迹法将蛋白转至 PVDF 膜上，室温下封闭膜 2 h 后，加入1250 的一抗稀释液，室温振摇 2 h，用 TweenPBS 液洗膜 3 遍. 再加入 18000 的 HRP 标记二抗稀释液，室温振摇 1 h 后用 TweenPBS 液洗膜 3 遍. 将膜浸入 DAB 显色液中在室温下充分显色后立即用蒸馏水洗膜，将膜转入 PBS 液中，观察并照相，凝胶成像系统分析光密度值. 统计学处理：采用 SP
16、SS 12.0 软件进行统计分析，实验数据用 xs表示, 进行单因素方差分析及 LSDt 检验进行组间的两两比较. P0.05 为有统计学差异. 2 结果 2.1 各组 CFs 的增殖和羟脯氨酸测定与对照组相比，Ald 组可明显增加 CFs 增殖和羟脯氨酸含量（P0.05）. 与 Ald 组比较，Ald+Spi, Ald+CsA 组的 CFs 增殖和羟脯氨酸含量明显减少（P0.05）. 与Ald+Spi 组比较，Ald+CsA 组的 CFs 增殖和羟脯氨酸含量明显增加（P0.05，表 1）. 羟脯氨酸在胶原蛋白中占 13.4%，在弹性蛋白中占极少量，其它蛋白中均不存在. 2.2 各组 CFs
17、的 CaN mRNA，蛋白测定与对照组相比，Ald 组的 CaN mRNA，蛋白水平均明显升高（P0.05） ，并呈浓度依赖性，10-7mol/L Ald 组的 CaN mRNA，蛋白水平明显高于 10-8mol/L 和 10-9mol/L Ald 组（P0.05）. 与 Ald 组相比，Ald+Spi，Ald+CsA 组的 CaN mRNA，蛋白水平明显降低（P0.05）. Ald+Spi 组比较，Ald+CsA 组的 CaN mRNA，蛋白水平没有差异性(图 1,2，表 1).表 1CFs 的增殖、羟脯氨酸、CaN mRNA 和蛋白的表达(略） 3 讨论 CaN 是胞内 Ca2+信号诱导核
18、内肥大基因活化的中心环节2-3. CaN 是一个由 Mr103 为 61 的催化 A 亚基和 19 的调节 B 亚基组成的二聚体，A 亚基与 CaM 结合，B 亚基与钙结合. 在心肌细胞中,当钙、CaM 分别结合至 CaN 的调节和催化亚单位时，CaN 活化并直接与胞浆活化 T 细胞因子 3(NFAT3)结合，使 NFAT3 氨基端调节区去磷酸化并转位入核. NFAT3可诱导心脏胚胎期基因如心钠素（ANP） ，脑型利钠素（BNP） ， 肌球蛋白重链（MHC ）等的表达，引起心肌重构4. 研究已证实心肌能通过自分泌或旁分泌方式产生醛固酮，心肌局部的醛固酮比血液中浓度高 17 倍，其可促进 CFs
19、 增殖和胶原合成，在心肌纤维化中起着重要的作用5. 本研究显示，外源性醛固酮可诱导 CFs 增殖和胶原合成，同时呈浓度依赖性升高 CaN mRNA、蛋白水平，而 CaN 特异性抑制剂 CsA 可抑制 Ald 诱导的 CFs 增殖和胶原合成，并降低 CaN mRNA、蛋白表达，提示 CaN 信号通路参与了 Ald 致心肌纤维化的过程. Ald 信息通路包括基因组通路与非基因组通路. 基因组通路指经盐皮质激素受体（MR）介导的信号通路，Ald 与 MR 结合后脱离热休克蛋白，入核与基因组激素应答元件(HRE) 结合并调控转录，如上调 Ang1 型受体(AT1R) mRNA 转录6 ，激活 KRas
20、 信号转导通路7等，MR 拮抗剂 Spi 能阻断此条通路. 非基因组通路是 Ald 经细胞膜受体，在短时间内激活胞内磷酯酶 C (PLC)，激活 Na+K+ 泵等来发挥作用，MR 拮抗剂Spi 不能阻断此条通路. 有实验表明，Ald 增加心肌收缩力和血管收缩的作用是通过非基因组通路介导的，而 Ald 对细胞的 DNA 和胶原合成的影响是通过基因组通路介导的8. 本实验表明，Spi 在逆转 Ald 促进CFs 增殖和胶原合成的同时，降低 CaN 表达，说明 Ald 上调 CaN 表达是通过 MR 介导的基因组通路的. 另外本实验观察到，与 Ald+Spi 组比较，Ald+CsA 组的 CFs 增
21、殖和羟脯氨酸含量明显增加，而 CaN mRNA，蛋白水平没有差异性，提示 CaN 特异性抑制剂 CsA 在明显抑制 CaN mRNA，蛋白水平时，不能完全抑制 Ald 诱导的 CFs 增殖和胶原合成，CaN 信号只是Ald 致心肌纤维化的众多信号通路的一种. 【参考文献】 1冯惠平，崔炜，单保恩，等. 醛固酮降低新生大鼠心肌成纤维细胞 iNOS 表达和 NO 含量J. 基础医学与临床，2005, 25(2): 152-155. 2林瑶，牛勃，解军，等. SiRNA 对大鼠钙调神经磷酸酶活性及 VSMCs 增殖的影响J. 第四军医大学学报，2006,27(18):1687-1689. 3Molk
22、entin JD, Lu JR, Antos CL, et al. A calcineurindependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophyJ. Cell, 1998, 93(2): 215-228. 4Liang Q, De Windt LJ, Witt SA, et al. The transcription factors GATA4 and GATA6 regulate cardiomyocyte hypertrophy in vitro and in vivoJ. J Biol Chem, 2001, 276(32)
23、: 30245-30253. 5Lijnen PJ, Petrov VV. Role of intracardiac reninangiotensinaldosterone system in extracellular matrix remodelingJ. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 2003, 25(7): 541-564. 6Robert V, Heymes C, Silvestre JS, et al. Angiotensin AT1 receptor subtype as a cardiac target of aldosterone: rol
24、e in aldosteronesaltinduced fibrosisJ. Hypertension, 1999, 33(4): 981-986. 7Stockand JD, Meszaros JG. Aldosterone stimulates proliferation of cardiac fibroblasts by activating KiRasA and MAPK1/2 signalingJ. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2003, 284(1): H176-H184. 8Chai W, Garrelds IM, Arulmani U, et al. Genomic and nongenomic effects of aldosterone in the rat heart: why is spironolactone cardioprotective?J. Br J Pharmacol, 2005, 145(5): 664-671.
