1、肝型脂肪酸结合蛋白和脂肪酸合成酶在乳腺浸润性导管癌的表达变化及其意义作者：李华, 吕青 薛晖, 陈红【摘要】 目的: 探讨肝型脂肪酸结合蛋白（LFABP ）和脂肪酸合成酶（FAS）与乳腺浸润性导管癌发生发展的关系。方法: 用半定量逆转录聚合酶链反应、 免疫组织化学和 Western blot 等方法检测 LFABP 、 FAS 和血管内皮生长因子（VEGF）在 86 例乳腺浸润性导管癌中的表达变化。结果: LFABP 和 FAS 主要分布于浸润性导管癌的腺泡和导管上皮细胞, LFABP 的 mRNA 和蛋白质的表达量在级浸润性导管癌的较、 级明显上调（P0.05） 。相反, FAS 的表达量在
2、级浸润性导管癌的较、 级明显下调, 两者的表达无明显相关性（P0.05） 。但是, LFABP 的表达与 VEGF 呈明显相关性。结论: 在级浸润性导管癌, 随着 FAS 表达下调, LFABP 和 VEGF 的表达上调。 【关键词】 基因和蛋白质表达; 肝型脂肪酸结合蛋白; 脂肪酸合成酶; 乳腺癌肝型脂肪酸结合蛋白(liver fatty acid binding protein, LFABP) 是首次从肝中克隆出来的小分子蛋白质, 相对分子质量（Mr）约 15 000。有研究发现, LFABP 在肝细胞癌和肝母细胞瘤中呈过度表达, 在乳腺癌细胞株 MCF7 和 T47D1和前列腺细胞株 D
3、U1452的表达较正常乳腺细胞株明显上调, 在乳腺浸润性导管癌组织的表达量较纤维腺瘤明显增加3, 提示 LFABP 与肿瘤的密切关系。脂肪酸合成酶（fatty acid synthase, FAS）在哺乳动物的内源性脂肪酸合成中起的关键作用。FAS 合成产物有棕榈酸盐（80%） 、 豆蔻酸盐（10%）和硬脂酸盐（10%）, 在人多数恶性肿瘤中呈过度表达, 被认为是不良预后的分子标志。最近很多证据显示, FAS 不但可整合与癌细胞代谢、 增殖和存活有关的信号传导通路, 还通过调节与恶性特征有关的 Her2/neu(erbB2) 、 ER 等癌蛋白, 在肿瘤发展中扮演着重要的角色。作为结合及转运长
4、链脂肪酸的 LFABP 与 FAS, 其在乳腺癌中的作用及其相互关系尚不清楚。大部分的脂肪酸结合蛋白与长链脂肪酸以 11 的比例结合, 但是1 摩尔的 LFABP 可结合 2 摩尔的长链脂肪酸以及乙酰基辅酶 A、 溶血磷脂、 亚铁血红素和胆汁盐等疏水性配体。鉴于 LFABP 在恶性肿瘤中的表达及其与脂肪酸的亲和能力, 我们检测了 LFABP 和 FAS 在乳腺浸润性导管癌的表达变化以及它们与临床病理指标的关系。此外, 由于脂肪酸是通过血液运输的, 我们还探讨了 LFABP 的表达与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF)的关系。1 材
5、料和方法1.1 材料 2005-05/2007-03 在四川大学华西医院乳腺外科收集浸润性导管癌标本 86 例（表 1）, 年龄 3867 岁（51.288.21 岁）, 患者术前未经化疗或放疗。术中所取标本经患者知情同意。所取标本均立刻置于液氮中保存备用。组织/细胞总 RNA 提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。逆转录试剂盒（Revert AidTM first strand cDNA synthesis kit）购自 Fermentas 公司。PCR 反应预混液购自 TaKaRa 公司。小鼠抗人 LFABP 抗体购自 RD 公司。兔抗人 FAS、 VEGF、 actin 和辣根标记山羊
6、抗小鼠 IgG 和山羊抗兔 IgG（用于 Western blot）购自 Santa Cruz 公司。APES、 DAB 和过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒 SP9001 、 SP9002 （用于免疫组织化学染色）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。即用型 SABC 免疫组化染色试剂盒 SA1025购自武汉博士德生物工程有限公司。PVDF 膜购自 Millipore 公司。增强型化学发光试剂盒购自 Pierce 公司。表 1 患者的主要临床病理学资料1.2 方法1.2.1 RTPCR 检测 总 RNA 提取及 cDNA 的逆转录严格按照相应的试剂盒中的说明操作。用 TaKaRa 公司设计、
7、合成的引物进行目的片段的 PCR 扩增。引物序列见表 2。对不同样本, 用紫外分光光度计（Eppendorf）测定 cDNA 浓度, 取等量 cDNA 进行 PCR 反应。25 L 反应体系中含 cDNA 模板 1 L, PCR 预混液 12.5 L, 目的基因上、 下游引物（0.5 mol/L）各 1 L, 反应共 28 个循环。对 RTPCR 产物进行12 g/L 琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像系统观察照相, Quantity One 软件测定目的条带与 actine 的光密度比值。表 2 LFABP 、 FAS、 VEGF和 ACTIN 基因 RTPCR 反应的引物序列1.2.2 免疫组织化
8、学染色 APES 处理玻片 , 石蜡切片常规脱蜡至水, 一抗 LFABP 的浓度为 150, 其余为 1100, 以 PBS 缓冲液替代一抗作阴性对照。染色步骤参照试剂盒, DAB 显色。阳性细胞百分数记数: 400 倍镜头下取五个不同的视野, 对每一视野连续计数 100 个细胞, 记录其中阳性细胞数, 取平均数。1.2.3 Western blot 分析 取 50100 mg 组织, 液氮下研细, 取 1 mL 裂解液 （7 mol/L 尿素, 40 g/L CHAPS (3 (3Cholamidopropyl)dimethylAmmonio 1Propanesulfonate), 40 m
9、mol/L DTT, 100 mol/L 苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF）, 0.05 g/L RNA 酶, 0.2 g/L DNA 酶, 0.01 g/L 溴酚蓝）与组织充分混匀, 4放置 15 min, 16 000 g, 4离心 40 min, 收集上清。测定每个样品的蛋白浓度。样品与1SDS 上样缓冲液（5SDS 上样缓冲液: 0.5 mol/L TrisHCl, pH6.8, 2.5 mL; 0.81 g/L DTT, 0.1 g/L SDS, 0.05 g/L 溴酚蓝, 甘油 2.5 mL）11 混匀, 100变性 5 min
10、。每孔加样 30 g。在 40 g/L 积层胶、120 g/L 分离胶中 80 V 分离蛋白质条带。200 mA 半干转 25 min(6.5 cm8.5 cm PVDF 膜)。膜分别与一抗 LFABP （1600） 、 FAS（1800） 、 VEGF（1800）和 actin （1800） 4孵育过夜, 与二抗（12 000）室温孵育 2 h。增强型化学发光试剂盒（Pierce）检测目的条带。Quantity One 软件测定目的条带与 actin 条带的光密度比值。1.2.4 统计学分析 用 SPSS13.0 软件进行统计学分析, 数据以xs 表示, 两组间均数比较用 t 检验。相关性分
11、析用 Pearson 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 RTPCR 结果 在 86 例浸润性导管癌组织中, 均检测到LFABP 、 FAS 和 VEGF mRNA 的表达。半定量 RTPCR 的结果显示, LFABP 和 VEGF 的表达在、 级浸润性导管癌较低, 在级明显上调（P0.05）, 在、 级之间的表达无显著性差异。而 FAS 的表达在、 级较高, 在级明显下调（P0.05, 表 3、 图 1） 。2.2 免疫组织化学染色结果 LFABP 和 FAS 阳性沉淀物分布于浸润性导管癌腺泡和导管的上皮细胞。LFABP 和 VEGF 的阳性细胞百分数在级较、 级明显增多,
12、 而 FAS 的阳性细胞百分数在、 级较高, 在级明显减少（P0.05）, 三者在、 级的阳性细胞百分数均无统计学意义（表 3, 图 2） 。表 3 T 检验结果显示 LFABP 、 VEGF 和 FAS mRNA 和蛋白质在 级浸润性导管癌的表达2.3 Western blot 分析结果 半定量 Wetern blot 的结果表明, LFABP 和 VEGF 在级乳腺浸润性导管癌的表达较、 级明显上调。FAS 在级浸润导管癌的表达最高, 在级降低, 在级较、 级明显下调（P0.05, 表 3、 图 3） 。以上 3 种方法同时验证, 与、 级乳腺浸润性导管癌相比, FAS 在级表达下调, 而
13、 LFABP 和 VEGF 表达上调。LFABP 的表达与FAS 无统计学意义（P0.05）, 但是与 VEGF 的表达有明显相关性（P0.05） 。LFABP 和 FAS 的表达与年龄、 淋巴结转移、 停经情况和雌、 孕激素受体的表达无关。图 3 Western blot 检测显示LFABP 、 VEGF 和 AS 在 级乳腺浸润性导管癌的表达变化3 讨论大量的实验证明, LFABP 具有促进肿瘤细胞增殖、 抑制分化的作用。转染了 LFABP 的肝细胞获得增殖能力。用 LFABP 的反义寡核苷酸处理 DU145 前列腺细胞株, 与细胞增殖相关的基因出现下调, 相反, 与细胞凋亡相关的基因上调
14、2 。用抑癌药物烷化剂 2 溴丙酮酸（BrPA）处理肿瘤细胞, 细胞增殖受到抑制, LFABP 的水平降低4 。但是, 在结直肠癌中, LFABP 的表达随着肿瘤分化程度的降低而降低, 从而被认为是结直肠癌的分化标志5, 6 。因此, LFABP 在不同类型的肿瘤可能有不同作用。我们的结果显示, LFABP 在级（低分化）浸润性导管癌的表达较级（高分化） 、 级（中度分化）明显上调, 证明 LFABP 与肿瘤细胞增殖和分化有关。此外, LFABP 可结合 FAS 的末端合成产物棕榈酸盐、 豆蔻酸盐和硬脂酸盐, 两者之间应有密切的关系。但我们的结果表明, LFABP 的表达与 FAS 的表达无相
15、关性。而且, LFABP 的表达在级导管癌增高, 但 FAS 的表达在级降低; LFABP 的表达与 VEGF 相关, 而 FAS 的表达与 VEGF 无关。分析有以下几种原因: 在癌变前期或中期, 微环境缺氧的异常情况下, 氧化作用所需能量可采用 FAS 途径, 通过消耗还原当量来平衡氧化还原反应, 维持肿瘤细胞的正常功能7, 而只有那些对有限的 O2 耐受的癌细胞才能存活。随着肿瘤细胞不断增殖, 代谢逐渐增强, FAS 的表达却明显下调, 此时细胞可能通过大量表达 LFABP 来缓解耗氧的压力。很多实验证明, LFABP 具有抗氧化作用。过度表达LFABP 的细胞系, 其细胞内的活性氧 (
16、reactive oxygen species, ROS)水平和所释放的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）较对照组明显减少8, 在单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstrction, UUO）模型中, 梗阻 7 d 后, 在对照组堆积大量的脂质过氧化作用（lipid peroxidation）产物, 但在转染了 LFABP 的小鼠中却未检测到脂质过氧化作用产物9, 进一步证明 LFABP 的抗氧化作用。此外, 依赖于 FAS 的内源性脂肪酸代谢减少的同时, Her2/neu 的表达受到抑制。FAS 与 Her2/neu 的功能及相互关系
17、的丧失可激活有利于细胞存活的抗缺氧分子, 促进 VEGF 上调。另外, 与 HFABP 、 EFABP 相比, LFABP 与 FAS 的末端合成产物棕榈酸盐的亲和力明显降低10, 提示, 在高表达 FAS 的、 级导管癌, 可能由 HFABP 和 EFABP 负责运输FAS 的合成产物, 随着 FAS 的表达的减少, E 、 HFABP 的表达也减少, 细胞代谢所需的脂肪酸由 LFABP 获取。而 LFABP 可能主要通过血流摄取细胞增殖所需的外源性脂肪酸11 。因此, 在级导管癌, 随 FAS表达减少, LFABP 和 VEGF 表达同时上调。在级浸润性导管癌, 由于 FAS 表达的减少
18、, 细胞增殖、 存活和恶性特征的维持有赖于 LFABP 的持续表达, 以弥补因 FAS 表达下调导致的氧气和脂肪酸的供应不足。【参考文献】1 Hammamieh R, Chakraborty N, Barmada M, et al. Expression patterns of fatty acid binding proteins in breast cancer cellsJ. J Exp Ther Oncol, 2005, 5(2): 133-143.2 Hammamieh R, Chakraborty N, Das R, et al. Molecular impacts of anti
19、sense complementary to the liver fatty acid protein (FABP) mRNA in DU 145 prostate cancer cells in vitroJ. J Exp Ther Oncol, 2004, 4(3): 195-202.3 李 华, 吕 青, 董立华, 等. 脂肪酸结合蛋白在乳腺组织的表达及意义J. 细胞与分子免疫学杂志, 2007, 23(4): 312-316. 4 Rajaraman G, Burczynski FJ. Effect of dexamethasone, 2bromopalmitate and clofi
20、brate on LFABP mediated hepatoma proliferationJ. J Pharm Pharmacol, 2004, 56(9): 1155-1161.5 Lawrie LC, Dundas SR, Curran S, et al. Liver fatty acid binding protein expression in colorectal neoplasiaJ. Br J Cancer, 2004, 90(10): 1955-1960.6 Pei H, Zhu H, Zeng S, et al. Proteome analysis and tissue m
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22、 Anderson J, et al. Antioxidative function of LFABP in LFABP stably transfected Chang liver cellsJ. Hepatology, 2005, 42(4): 871-879.9 Kamij Ikemori A, Sugaya T, Obama A, et al. Livertype fatty acidbinding protein attenuates renal injury induced by unilateral ureteral obstructionJ. Am J Pathol, 2006, 169(4): 1107-1117.10 Storch J, Thumser AE. The fatty acid transport function of fatty acidbinding proteinsJ. Biochim Biophys Acta, 2000, 1486(1): 28-44.
