1、高磺化 环糊精毛细管电泳分离分析手性芳香仲醇作者：刘鹏 何炜 秦向阳 王巧峰 李晓晔 张生勇【摘要】 以高磺化 环糊精为毛细管电泳手性选择剂，建立了有效分离 7 种手性芳香仲醇对映体的方法。在 20 mmol/L H3PO4 三乙醇胺为背景电解质(pH 2.5)，6%(m/V) 高磺化 环糊精为手性选择剂(SCD) ，柱温 20 ，操作电压-15 kV，检测波长 214 nm 等优化条件下，所有芳香仲醇对映体均实现基线分离。以本方法测定了 7 种芳香酮不对称氢转移反应产物 7 种手性芳香仲醇的百分对映体过量值(% ee)，其测定结果与高效液相色谱、气相色谱测定结果完全一致。本方法可以用于手性芳
2、香仲醇光学纯度的测定。 【关键词】 毛细管电泳，手性选择剂，环糊精, 手性分离，手性芳香仲醇，百分对映体过量值1 引 言手性芳香仲醇是重要的手性化合物，很多天然有机化合物和具有生理活性的物质都含有手性芳香仲醇的结构，采用高效液相色谱(HPLC)法对其进行分离测定已有文献报道1,2，而通过毛细管电泳测定的工作较少3,4。带负电的磺酰化 环糊精(SCD) 手性选择剂已被广泛用于一系列中性和带电化合物的毛细管电泳手性分离57，但却未见用于手性芳香仲醇光学纯度测定的研究报道。不对称氢转移反应是获得手性芳香仲醇的重要途径之一8。为了提高该类反应产物的光学纯度，已设计合成了大量的新型手性催化剂9,10。如
3、何评价这些催化剂的性能(特别是立体选择性)已成为迫切需要解决的问题。为了建立方便、快速和灵敏的百分对映体过量值(% ee)的测定方法，本实验以 SCD 为手性选择剂，H3PO4 三乙醇胺为背景电解质，建立了毛细管电泳拆分芳香仲醇对映体和测定不对称氢转移反应产物的百分对映体过量值(% ee)的方法。2 实验部分2.1 仪器与试剂P/A CETM MDQ 型毛细管电泳仪系统(美国 Beckman 公司); 配有二极管阵列检测器，BeckmanSystem Gold 软件和可控温度卡盒; 熔融空心石英毛细管柱(75 m i.d.375 m o.d., 总长 60 cm，有效长度 50 cm， 河北永
4、年锐沣色谱器件有限公司); 343 型自动旋光仪(美国PerkinElmer 公司); 320S pH 计(Metter Toledo 公司); Delta 320S pH 计(中国上海 Metter Toledo 公司)。高磺化 环糊精(SCD)( 美国 SigmaAldrich 公司); 2 甲基1 苯基1 丙酮、间 三氟甲基苯乙酮(美国 Acros 公司); 1 苯基1 丁酮(美国 Alfa Aesar 公司); H3PO4(HPLC 级，天津市科密欧化学试剂开发中心); NaOH(优级纯，中国医药集团上海化学试剂公司进口分装); 三乙醇胺(天津市红岩化学试剂厂)。其它试剂均为分析纯。实
5、验用水为去离子水(MilliQ 系统纯化)。运行缓冲液的配制：准确移取 0.068 mL H3PO4，用去离子水稀释至 50.0 mL，浓度为 20.0 mmol/L，在 pH 计监控下，用三乙醇胺调至 pH 2.5，精密移取 6.0 mL，在其中溶解 36 mg SCD ，即得 6 g/L 6%(m/V) SCD 的运行缓冲液(缓冲液均为实验前现配，防止SCD 水解)。样品溶液的配制：称取外消旋或对映体纯的芳香仲醇 10 mg，用40%甲醇定溶至 10 mL。实验前，用甲醇稀释至 50 mg/L(外消旋体)或 1 g/L(左旋体芳香仲醇)，进行分离实验。运行缓冲液和样品溶液需经 0.22 m
6、 微孔滤膜过滤，超声脱气 5 min 后使用。所有储备液均应保存于 4 冰箱中。2.2 实验方法所有测试用外消旋芳香仲醇样品均以相应的芳香酮为原料，在无水甲醇中用 NaBH4 还原制备。所测定的 7 种左旋体芳香仲醇样品是本实验室通过相应芳香酮的不对称氢转移反应获得10。7 种芳香仲醇的化学结构见图 1。 图 1 7 种芳香仲醇的化学结构在 50 mL 圆底烧瓶中加入 5 mmol 芳香酮，25 mL 无水甲醇，摇匀，待芳香酮溶解后加入 0.227 g NaBH4，室温搅拌 40 min，薄层层析法(TLC)监控(展开剂为 V(石油醚)V(乙酸乙酯)= 91 混合液，反应结束后，减压蒸除甲醇，
7、快速柱层析分离，得外消旋芳香仲醇无色液体。IR(KBr, cm-1): 3300(s), 3050(w), 2900(m), 1600(s), 1500(m), 1200(m)和 1000(s)。3 结果与讨论本实验中毛细管电泳手性分离度按式(1)计算：RS=2t2-t1w1+w2(1)式中，t1 和 t2 是两个对映体的迁移时间，w1 和 w2 是对映体各自以时间(min)为单位的基线峰宽。本实验中手性芳香仲醇百分对映体过量值(% ee)按式(2)计算：ee(%)=A1-A2A1+A2100(2)式中，A1 和 A2 表示对映体的相关峰面积，A/t 表示对映体各自峰面积除以相应的迁移时间(假
8、定 A1 是不对称反应主要产物的相关峰面积)。3.1 背景电解质类型对分离的影响以 SCD 为手性选择剂，在反极性电压模式下，分别考察了3 种缓冲体系(H3PO4 三乙醇胺、H3PO4 三乙胺和 TrisH3PO4) 。实验表明，在 20 mmol/L H3PO4 三乙醇胺缓冲体系中， 7 种手性芳香仲醇均能得到基线分离。因此，选择 H3PO4 三乙醇胺为毛细管电泳分析的缓冲溶液。3.2 SCD 浓度对分离度和迁移时间的影响考察了 SCD 浓度分别为 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%(m/V) 时各芳香仲醇分离度(Rs)。结果表明(图 2a)，随着 SCD 浓度增大，几乎所
9、有分析物的 Rs 都先增加后下降。当 SCD 浓度为 6%(m/V)时，(), (), (), () 和() 获得最好的分离，而() 和() 达到最大 Rs 的 SCD 浓度分别为 3%和 7% (m/V)。因 SCD 浓度增加，其与芳香仲醇对映体形成包合物的稳定性增加，左、右旋体的包合常数差异变大，因而 Rs 增大。当 SCD浓度达到 8%(m/V)时，电流已经200 A，焦耳热迅速增加，基线噪音明显增大，色谱峰变形。另外，随着 SCD 浓度增大，所有分析物的迁移时间(t)明显缩短(图 2b)，有利于快速分析。综合考虑，分离(), (), () 用 6%(m/V)SCD 较为合适，而分离()
10、 其浓度为 3%(m/V)。分离条件(separation conditions): 毛细管(capillary), 60 cm 50 cm 有效长度(effective length) 75 m i.d.; 背景电解质(background electrolyte, BGE)：20 mmol/L H3PO4 三乙醇胺缓冲液(phosphate buffertriethanolamine), pH 2.5; 温度(temperature) 20 ; 应用电压(applied voltage) -15 kV; 检测波长(UV detection at) 214 nm. 同图 1(- are sa
11、me as in Fig.1).3.3 缓冲溶液酸度对分离度和迁移时间的影响高 pH 下，毛细管柱表面 SiOH 解离，负电荷密度增加，电渗流(EOF)增加;随着 pH 降低，SiOH 解离受到抑制，EOF 降低。当pH2.5 时，质子化作用使 EOF 趋于 0，pH 改变对 EOF 的影响降至很小，这时 pH 只影响样品的解离平衡12。另外，pH 也影响 SCD 的电荷，进而对 SCD 与客体分子间的疏水、氢键以及包络作用等产生影响。本实验中负电性的 SCD 与中性的芳香仲醇形成带负电的络合物，在反极性电压模式下迁向正极，而电渗流则移向负极，这使中性芳香仲醇对映体得以分离。本实验在 20 m
12、mol/L H3PO4 中，用三乙醇胺调 pH 值分别为 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 及 4.0。以 6%(m/V) SCD 考察了缓冲液 pH 对分析物 Rs 和迁移时间 t 的影响。结果表明(图 3)： 当 pH=2.5 时，除() 和() 外，其它分析物的 Rs 均达到最大;当 pH=3.0 时，() 的 Rs 达到峰值;当 pH=3.5 时， () 的 Rs 最大。在 pH=2.5 时，() 和() 已经实现了基线分离。当 pH 继续升高时，因电流减小，EOF 不断增大，使所有分析物的 Rs 又趋于下降。另外，EOF 增大，样品移向正极的时间也明显延长。综合考虑，本实验选定的
13、最合适 pH 值为 2.5。分离条件(separation conditions): 背景电解质(BGE)为 6%(m/V) SCD; 其它条件同图 2(other separation conditions are the same as in Fig.2)。同图 1(- are same as in Fig.1).3.4 缓冲液浓度对分离度和迁移时间的影响分别取 15, 20, 25, 30, 40 及 50 mmol/L H3PO4，适量用三乙醇胺调至 pH=2.5，在-15 kV, 20 电泳条件下测定。结果表明(图 4)，随着 H3PO4 浓度增大，所有分析物的 Rs 都增大; 当
14、H3PO4 浓度为 2025 mmol/L 时，Rs 达到最大值;再增大其浓度，Rs 又缓慢下降，但迁移时间持续延长。因为在 EOF 趋于零时，随着缓冲液浓度增加，使分离样品表面的屏蔽作用增加，使表观电荷减小，荷质比下降，有效淌度减小，迁移时间增加，Rs 得到改善13。然而，缓冲液浓度继续增大时，峰电流的增加将导致焦耳热的增加并最终引起峰变形，同时，由于迁移时间延长，区带展宽，并影响了 Rs 的增加。综合考虑，H3PO4 浓度选择 20 mmol/L。分离条件(separation conditions): 背景电解质(BGE)： 6%(m/V) SCD; 其它条件同图 2(other sep
15、aration conditions are the same as in Fig.2 )。同图 1( are the same as in Fig.1).3.5 毛细管柱温和工作电压对分离度和迁移时间的影响毛细管柱温变化不仅影响分离重现性，也影响分离效率。在通常条件下，电渗淌度(eo)和电泳淌度(ep)与溶液粘度、双电层 zeta 电位和介电常数的关系可用式(3)和式(4)表示14: eo=or(3)ep=2or3(4)式中， 为缓冲液粘度， 为 zeta 电位，r 为介电常数，o 为真空介电常数。由式(3)和式(4)可知， eo 和ep 与溶液粘度成反比。当温度升高时，缓冲液粘度降低， e
16、o 和ep 随之增大， EOF 减小，而电泳速度增大，迁移时间缩短;另一方面，SCD 和对映体之间的包合作用是一个快速的平衡过程，平衡常数随温度的增加而减小。因此，温度逐渐升高时，样品的 Rs 下降。综合考虑，最佳温度为 20 。电压对 Rs 和 t 的影响结果见图 5。随着分离电压的增加，对映体的 Rs 增大，迁移时间缩短，有利于芳香醇的手性分离。但当电压超过-15 kV 时，电流超过-170 A，焦耳热快速增加，使柱效反而降低，样品峰高也随之降低。因此，本实验选择的分离电压为-15 kV。分离条件(separation conditions): 除电压外，其它条件同图2(except ap
17、plied voltage, other separation conditions are the same as in Fig.2)。同图 1( are the same as in Fig.1).3.6 优化条件下的电泳分离通过对各种分离条件的考察，实现 7 种外消旋芳香仲醇有效分离的最佳条件是：在反极性电压模式下，区带毛细管电泳(CZE) 运行缓冲液为 20 mmol/L H3PO4 三乙醇胺，pH 2.50, SCD 浓度为 6%(m/V)，柱温 20 ，分离电压-15 kV。此条件下，7 种手性芳香仲醇实现了基线分离，其电泳图见图 6。3.7 样品测定用本方法测定了 7 种不对称氢
18、转移反应产物的百分对映体过量值(% ee)，并与 HPLC 或 GC 方法测定结果进行比较(表 1)。所有样品测定 5 次，相关峰面积(A/t)和迁移时间的相对标准偏差(RSD)分别为 3.8%和 1.4%。结果表明，用 CZE 方法测定的 7 种不对称氢转移反应产物样品的 ee 值与传统的 HPLC 或 GC 法测定结果有很高的一致性，测定 ee 典型的电泳图见图 7。证明本方法准确可靠，能用于手性芳香仲醇的分离分析和对映体过量值的测定。分离条件(separation conditions): 背景电解质(BGE)： 20 mmol/L H3PO4 三乙醇胺缓冲液(phosphate buf
19、fertriethanolamine), 6%(m/V) SCD; pH 2.5; 其它条件同图 2(other separation conditions are the same as in Fig.2)。表 1 7 种芳香仲醇百分对映体过量值的 CZE 和 HPLC 或 GC 测定结果25D 绝对构型 aConfigurationa94.595.0-47.5S93.794.0-32.4S95.496.0-43.0S96.397.0-48.1S94.295.0-20.7S96.797.0-51.6S76.477.0-20.9S a. 手性芳香仲醇的绝对构型是根据其旋光方向与同一已知化合物进
20、行比较而确定(configuration were assigned by comparison with the sign of specific rotation of known compounds)。图 7 7 种芳香仲醇的百分对映体过量值测定的毛细管电泳色谱图【参考文献】1 Wainer W, Stiffin R M, Shibata T. J. Chromatogr., 1987, 411: 1391512 Fukui Y, Ichida A, Shibata T, Mori K. J. Chromatogr., 1990, 515: 85903 Zhu W, Vigh G. An
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