1、高效液相色谱 荧光 紫外法测定动物肌肉组织中多类药物残留作者：李存 江海洋 吴银良 王战辉 赵思俊 【摘要】 建立了同时检测动物肌肉组织中 9 种喹诺酮类药物、7 种磺胺类药物和甲氧苄啶的高效液相色谱检测方法。动物肌肉组织样品用磷酸盐缓冲液提取，HLB 固相萃取柱净化，洗脱液用氮气吹至近干，磷酸盐缓冲液复溶，以甲酸水溶液 乙腈体系为流动相，梯度洗脱，荧光 紫外检测器串联测定。本方法的线性良好，相关系数 r0.9987;平均回收率为 70.6%103.4%，相对标准偏差为 1.2%11.4%; 荧光检测器测定喹诺酮类药物的检出限为 0.040.4 g/kg;紫外检测器测定磺胺类药物和甲氧苄啶的检
2、出限为 3.5 g/kg。本方法具有简便、通用性强的特点，适用于动物肌肉组织中上述药物的常规残留检测。 【关键词】 喹诺酮类药物，磺胺类药物，甲氧苄啶，动物肌肉组织，高效液相色谱法，多残留检测1 引 言喹诺酮类药物(quinolones，QNs)和磺胺类药物(sulfonamides，SAs)都属于人工合成的抗菌药物，因其抗菌谱广而广泛用于预防和治疗食品动物的多种感染性疾病。甲氧苄啶(trimethoprim，TMP)作为一种抗菌增效剂，可以增强 QNs 和 SAs 的抗菌作用，常与其配合使用1。这些药物在兽医临床广泛和大量的使用必然会导致其在动物性食品中的残留，严重危害人类的健康。我国和欧盟
3、都已制定了多种 QNs 和 SAs 在动物组织中的最高残留限量2,3。QNs 或SAs 在动物组织中与高效液相色谱(HPLC)串联的检测方法主要有紫外法(UV)47、荧光法(FLU)8,9和质谱法(MS)1012。国家标准中，检测猪和鸡组织中 QNs 残留的 HPLC 方法的检出限为 20 g/kg13，SAs残留的 HPLC 方法的检出限为 1020 g/kg14。为提高检测效率，多类(multiclass) 残留检测,即一个方法可以同时检测两类以上的药物，已成为发展趋势1517。但有些方法灵敏度较差17，或仪器价格昂贵不易推广应用16，或检测药物较少15,17，而且不能同时测定TMP151
4、7，甚至在提取和净化中使用大量的毒性高的有机溶剂，如使用氯制剂5,7,9。本研究建立了同时检测动物肌肉组织中 9 种 QNs、7种 SAs 和 TMP 的 HPLC 检测方法。组织样品用磷酸盐缓冲液提取，固相萃取柱净化，方法简便、通用性强、有机溶剂用量少。2 实验部分2.1 仪器与试剂Waters 26952996 高效液相色谱仪，配备有 2487 紫外检测器和2475 荧光检测器(美国 Waters 公司); HLB 固相萃取柱 (60 mg，3 mL，美国 Waters 公司)。磷酸盐缓冲液：称取 2.0 g K2HPO43H2O 和 8.0 g KH2PO4，纯水溶解并定容至 1.0 L
5、。2.2 色谱条件色谱柱：SymmetryShildTM RP18(150 mm3.9 mm，i.d.，5 m，美国 Waters 公司)。流动相：0.1%甲酸水溶液(A) 乙腈(B)。梯度洗脱条件： 94% A(0 min)，93% A(5 min)，93% A(15 min)，90% A(20 min)，85% A(25 min)，40% A(41 min)，30% A(42 min)，94% A(43 min)，94% A(55 min)。流速：0.7 mL/min;进样量： 100 L;柱温：30 。紫外检测波长：280 nm。程序荧光检测波长： 011 min， ex=297 nm，
6、em=515 nm;1125 min，ex =280 nm，em =450 nm;2555 min，ex =320 nm，em =365 nm。2.3 样品前处理准确称取(2.000.02) g 匀浆猪和鸡肌肉组织于 50 mL 聚丙烯离心管中，加入 8 mL 磷酸盐缓冲液，涡动 1 min，以 3800 r/min 离心 10 min，上清液倒入另一个 50 mL 聚丙烯离心管中;向组织凝块中加入 8 mL磷酸盐缓冲液重复提取一次，合并上清液，向上清液中加 14 mL 水，涡动混匀，以 3800 r/min 离心 10 min，取上清液，过 HLB 固相萃取柱(2 mL 甲醇活化和 2 mL
7、 水平衡)，5 mL 甲醇 水(14，V/V)洗涤，2 mL 甲醇洗脱于刻度试管中，45 水浴中氮气吹至近干。用磷酸盐缓冲液定容至 1 mL，涡动 30 s，以 0.22 m 针孔式滤膜过滤，取 100 L 进 HPLC分析，QNs 用 FLU 检测器检测，SAs 和 TMP 用 UV 检测器检测。3 结果与讨论3.1 色谱条件的选择由于结构和化学性质的差异，同时检测和分离两类以上结构不同药物对色谱条件要求较高。本研究分别对多种型号和规格的色谱柱进行考察和比较，采用 SymmetryShildTM RP18 色谱柱可成功分离 QNs、SAs和 TMP。QNs 和 SAs 均为两性化合物，流动相
8、酸度对其分离影响很大，而且QNs 在酸性溶液中有较强荧光发射18。本实验采用甲酸水溶液 乙腈体系为流动相，对不同浓度甲酸的分离效果进行了比较，降低甲酸的浓度会导致 QNs 的色谱峰拖尾，而且 3 类药物不能完全分离，最终选择 0.1%甲酸 乙腈体系作为流动相。通常，SAs 和 TMP 使用 UV 检测器，而 QNs 常使用 FLU 检测器，且不同的 QNs 的荧光光谱又相差较大。本实验采用常规的 UV 检测器串联程序波长 FLU 检测器测定样品，一次进样可以同时检测 3 类药物，而且都能获得较高的灵敏度。程序 FLU 检测波长见 2.2 项。FLU 和 UV 检测器各药物的色谱峰尖锐、对称(见
9、图 1)。图 1 标准品色谱图(a, d, g, j);猪肉添加色谱图(b, e);空白猪肉色谱图(c, f);鸡肉添加色谱图(h, k);空白鸡肉色谱图(i, m)1. 甲氧苄啶(trimethoprim); 2. 麻保沙星(marbofloxacin); 3. 磺胺嘧啶(sulfadiazine); 4. 氧氟沙星(ofloxacin); 5. 磺胺吡啶(sulfapyridine); 6. 磺胺噻唑(sulfathiazole); 7. 环丙沙星(ciprofloxacin); 8. 洛美沙星(lomefloxacin); 9. 单诺沙星(danofloxacin); 10. 恩诺沙星(
10、enrofloxacin); 11. 磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine); 12. 沙拉沙星(sarafloxacin); 13. 磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine); 14. 磺胺甲噁唑 (sulfamethoxazole); 15. 恶喹酸(oxolinic acid); 16. 磺胺苯酰(bensoylsulfanilamide); 17. 氟甲喹(flumequine)。3.2 样品前处理条件的优化本研究试图减少毒性大的有机溶剂在提取和净化中的使用，磷酸盐缓冲液可以有效提取(氟)喹诺酮类药物8,19，但磷酸盐缓冲液提取组织样品中 SAs 的方法报道很少1
11、5。本研究考察了不同组成、不同浓度、不同 pH 值的多种磷酸盐缓冲液的提取效果，最后确定采用K2HPO4KH2PO4 缓冲液(pH=6.0)同时提取猪和鸡肌肉中的 QNs, SAs 和TMP，并对提取条件进行了优化，取得了满意的回收率，结果见表 1。多类药物的残留分析方法常采用较复杂的前处理过程，本研究对多种固相萃取柱进行比较，最后采用单个 HLB 固相萃取柱同时净化 QNs, SAs 和 TMP，获得较好的净化效果。组织提取液加水稀释后离心，可以减少共萃取杂质的干扰，加快提取液过柱的速度，防止固相萃取柱阻塞。在柱洗脱过程中，用 1 mL 甲醇洗脱，只有磺胺苯酰的回收率较低(60%)， 增加
12、1 mL 甲醇，磺胺苯酰的回收率提高，且不增加共萃取杂质的干扰。整个提取和净化过程仅采用甲醇一种有机溶剂，体积仅 8 mL，避免了大量使用有机溶剂对环境的污染。表 1 猪、鸡肌肉组织中药物的添加回收率及精密度测定3.3 检测方法的验证所有药物在相应的浓度范围内，呈良好的线性关系，相关系数r0.9987。低、中、高 3 个浓度的样品添加回收率为70.6%103.4%，相对标准偏差(RSD)为 1.2%11.4%; 可以满足残留分析的需要，结果见表 1。典型的标准品、肌肉添加和空白肌肉色谱图见图1。取空白的肌肉样品，平行 10 份，按 2.3 样品前处理的方法处理，QNs 用 FLU 检测器检测，
13、SAs 和 TMP 用 UV 检测器检测，以信噪比 S/N=3为检出限，S/N=10 为定量限。SAs 和 TMP 的检出限和定量限分别为 3.5和 12 g/kg。QNs 的检出限和定量限分别为 0.2 和 1.0 g/kg(其中，单诺沙星为 0.04 和 0.2 g/kg;麻保沙星为 0.4 和 2.0 g/kg; 沙拉沙星为 0.4 和 2.0 g/kg)。【参考文献】1 Shen JianZhong( 沈建忠), Xie LianJin( 谢联金).Veterinary Pharmacology(兽医药理学). Beijing(北京)：China Agricultural Univer
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