1、高压氧和低压缺氧预处理对家兔大脑中动脉闭塞后脑梗死的防治作用及其机制【摘要】 目的：观察高压氧预处理（HBOP）和低压缺氧预处理（HHP）对兔大脑中动脉闭塞（MCAO）后局灶性脑梗死程度及周围脑组织氧分压(PbtO2)的影响. 方法：雄性家兔 72 只随机分为单纯 MCAO 组，HBOPMCAO 组(100% O2, 2.5 ATA, 1 h/d, 5 d)和 HHPMCAO 组(4000 m, 61.6 kPa, 3 d)，每组 24 只, 采用改良 Bederson 法建立家兔 MCAO 模型，分别于 MCAO 前、MCAO 后 1,3 和 10 d 观察脑 MRI 信号强度、脑梗塞灶体积
2、及梗塞灶边缘 PbtO2. 结果：MRI 结果显示 MCAO 后 3,10 d 时HBOPMCAO 组和 HHPMCAO 组缺血区异常信号范围较单纯 MCAO 组明显缩小，HBOPMCAO 组缺血区标准化信号强度（SIR）于 3,10 d 时分别为1.620.09, 1.170.10；HHPMCAO 组缺血区 SIR 于 3,10 d 时分别为1.640.06, 1.200.09；均低于单纯 MCAO 组的 1.830.07, 1.360.06 (P0.05). TTC 染色显示的梗塞灶体积在 3 和 10 d 时HBOPMCAO 组和 HHPMCAO 组小于单纯 MCAO 组；HBOPMCA
3、O 组家兔梗塞灶边缘 PbtO2 于 1,3 和 10 d 时分别为（8.270.58）, （11.921.27）和（16.121.42） mmHg；HHPMCAO 组家兔梗塞灶边缘 PbtO2 分别为（8.460.90）, （10.771.19）和(15.331.29) mmHg,均高于单纯 MCAO 组的(7.031.06),(8.430.86)和(11.831.28) mmHg (P0.05). 结论: HBOP 及 HHP 对家兔 MCAO 后局灶性脑缺血具有一定的防治作用. 【关键词】 高压氧 缺氧 局灶性脑缺血 0 引言 Wada 等1在 1996 年报道提示高压氧预处理(hype
4、rbaric oxygen preconditioning, HBOP)对缺血性脑损伤有缺血耐受作用，HBOP 的研究目前仍不多，近年缺血耐受现象研究报道主要集中在低压缺氧预处理(hypobaric hypoxia preconditioning, HHP)方面1-2 ，更缺乏 HBOP和 HHP 脑保护作用比较研究. 本研究利用家兔大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型，观察 HBOP 和 HHP 对 MCAO 家兔脑 MRI、脑梗塞灶体积及梗塞灶边缘脑组织氧分压(partial pressure of brain tissue o
5、xygen, PbtO2)的影响，探讨 HBOP 和 HHP 对缺血性脑损伤的保护作用及相关机制. 1 材料和方法 1.1 材料体质量 2.02.5 kg,34 月龄的雄性家兔 72 只（第三军医大学实验动物中心提供） ，随机分为单纯 MCAO 组，HBOPMCAO 组和HHPMCAO 组，每组 24 只. 于各组中分别随机抽取 6 只动物不行 MCAO 作为对照组，余下动物在 MCAO 后 1,3 和 10 d 各时相点分别随机抽取 6 只动物进行相关指标检测. 动物禁食但不禁水 12 h 后，采用改良 Bederson法3经眶后入颅制作家兔 MCAO 的模型. 1.2 方法 1.2.1 预
6、处理动物高压氧和低压缺氧预处理参照文献4进行. 1.2.2MRI 检查方法及图像分析使用 Simens sonata 1.5T 超导 MRI 机. 家兔 MCAO 后在规定时相点均行 MRI 检查, 运用图像分析软件ANALYZE（Version 7.5, CNSsoftware, Rochester, MN, USA）测定不同时相点 T2WI 异常信号体积(异常信号区面积层厚层数)，计算体积比异常信号体积/同侧半球体积100%表示；在右侧基底节区、颞叶部位缺血区选取固定的感兴趣区（ROI, 0.3 cm）,应用 MR 内固定软件，测量不同层面感兴趣区 T2WI 的平均信号强度，同时测量相应层
7、面感兴趣区对应的左侧镜像区的平均信号强度，二者的比值为标准化信号强度（SIR）5. 1.2.3 脑组织梗塞体积测定实验动物处死，快速取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，-20下冰冻 30 min. 将脑冠状切成五片，用 4 g/L 的 2, 3, 5 氯化三苯四氮唑(TTC)磷酸盐缓冲液染色，检测梗死灶体积大小. TTC 染色结果判定：正常脑组织区域染为红色，缺血梗塞区脑组织为灰白色. 梗死灶体积按公式 V=SD/2 计算(S 为每一脑片梗死灶面积,D 为脑片厚度)，所有脑片梗死灶体积之和为梗死灶总体积. 1.2.4PbtO2 监测在动物术后各预定时相点, 30 g/L 异戊巴比妥钠（60 mg/
8、kg）麻醉,麻醉成功后将家兔固定,根据 MCAO 后首次 MRI 显示的梗塞灶边界钻孔插入脑组织氧监测探头，插入深度 12 mm，连接 LICOX CMP 组织氧监测仪，待各参数稳定后，维持 45 min 后，记录结果. 统计学处理: 计量资料采用 xs 表示. 采用 SPSS11. 0 统计软件处理，组间均数比较采用方差分析及 LSOt 检验，组内比较采用随机区组方差分析. 2 结果 2.1 对 MRI 信号范围和强度的影响家兔脑 MRI 不同时相点均表现缺血区 T2WI 呈高信号，其中 1 d 时高信号影显示较均匀，主要在右基底节区和右侧大脑半球颞顶叶，三组的信号范围及强度无明显差别. 3
9、 d 时T2WI 高信号影范围稍扩大且欠均匀，边界较模糊，平均信号强度增高，但 HBOP 和 HHP 组信号强度及范围明显小于单纯 MCAO 组.10 d 时三组T2WI 高信号范围缩小，信号强度降低，多位于顶叶或颞叶,二预处理组信号范围及强度均显著小于单纯 MCAO 组（P0.05,表 1）. 表 1MCAO 后T2WI 异常信号范围及强度 2.2 对脑梗塞灶体积和脑组织 PbtO2 的影响 MCAO 第 1 日三组家兔大脑基底节区及颞叶部位出现明显梗死灶，且梗死体积三组间无明显差异. 第 3 日达高峰，但 HBOP 和 HHP 组脑梗死体积明显小于单纯 MCAO 组. 第10 日三组梗死灶
10、均明显缩小，二预处理组显著优于对照组（P0.05, 图 1,表 2). 3 讨论 Astrup 等6于 1977 年在狒狒 MCAO 模型中发现，缺血坏死区周围皮质局部脑血流量降至 15 mL/(100 g/min)时，自主细胞活动消失而细胞间隙 K+浓度突然升高，神经细胞死亡，由此提出了坏死核心区（infarcted core, IC）和缺血半暗带（ischemia penumbra, IP）的概念，并且认为缺血核心区是不可逆损害，而细胞功能停止但结构完整的半暗带区是可逆损伤区. Hakim 等7从临床干预治疗的角度将半暗带定义为“潜在的可逆性缺血组织”. PbtO2 反映了局部脑组织内氧的
11、水平，可反映局部脑组织缺血程度，而 PbtO2 监测仪具有微创、稳定、灵敏、客观、直接的特点，可独立提供脑氧的信息8. 我们前期研究4,8提示 PbtO2 监测能反映颅脑损伤后局部的脑缺氧状况，及时准确反映伤情变化. 本实验在建立家兔 MCAO 后 1 d 将 PbtO2 探头置于梗塞灶边缘 MRI 所示的异常信号灶，发现家兔 MCAO 后 PbtO2 明显下降(P0.05), 单纯 MCAO 组在 MCAO 后 1 d 时 PbtO2 仅为 MCAO 前的 24%，但随着时间的推移，梗塞灶周围的 PbtO2 不断升高，可能是脑水肿等消退后颅内压下降，从而改善脑的血供，而这种 PbtO2 水平
12、的升高，则可能是“缺血半暗带”细胞功能恢复的前提条件. 我们对高压氧预处理后颅脑外伤的观察发现，预处理组 MMP9 表达明显减少，且电镜见血脑屏障的损伤较对照组轻，提示高压氧预处理对颅脑损伤的神经保护作用的机制可能与抑制 MMP9 的表达有关4. Kim 等9发现高压氧预处理组的过氧化氢酶的活性和过氧化氢酶基因的表达都比对照组高，而应用了过氧化氢酶抑制剂后，高压氧预处理的缩小心肌梗死面积作用消失，提示高压氧作用效应的机制可能与过氧化氢酶的作用有关. Duan 等10比较自由基清除系统的变化发现，与未预处理组相比，仅低氧处理 1 次组整个脑区的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶的活性明
13、显降低，而海马脂质过氧化物的浓度明显升高. 但是经低氧处理 4 次后，它们的水平趋向于恢复至正常对照组水平，提示氧自由基和它们的特异清除酶参与了低氧耐受形成. 研究均提示氧自由基及其内源性清除酶系统参与了 HBOP 和 HHP 致脑缺血耐受的形成和发展，而且自由基可诱导 HIF1 表达上调，HIF1 的上调促进其下游基因的转录可提高低氧的耐受能力1,11. 这也是 HBOP 和 HHP 的神经保护作用无明显差异的可能原因之一. HBOP 和 HHP 的对脑缺血的神经保护机制不完全一致，有待进一步研究. 【参考文献】 1 Wada K, Ito M, Miyazawa T, et al. Rep
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15、264-1269. 3 Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M, et al. Rat middle cerebral artery occlusion: Evlutation of the model and development of neurologic examination J. Stroke, 1986, 17(3):472-476. 4 胡胜利,冯华,刘智,等. 高压氧预适应对大鼠高原颅脑损伤的影响J. 军事医学科学院院刊, 2006,30(6):541-543. 5 Henninger N, KuppersTiedt L, Sicard KM, et a
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17、-57. 7 Hakim AM. Ischemic penumbra: The therapeutic windowJ. Neurology, 1998, 51(3Suppl 3):S44-S46. 8 胥全宏，冯华，王宪荣，等. 高原大鼠颅脑损伤局部脑组织氧分压变化特点J.中华神经外科疾病研究杂志，2005, 4(2):137-140. 9 Kim CH, Choi H, Chun YS, et al. Hyperbaric oxygenation pretreatment induces catalase and reduces infarct size in ischemic rat m
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