1、根际土壤溶液中磷的毛细管电泳分析作者：王震宇 温胜芳 李爱峰【摘要】 应用毛细管区带电泳间接紫外吸收法，对测定根际土壤溶液中 PO的检测波长、电泳温度、分离电压和电解液组成等参数进行了选择，发展了根际土壤溶液中 PO浓度的毛细管电泳分析法。选择后的电泳条件为：电解液为 32 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷+4 mmol/L 1,2,4-苯三酸+0.3 mmol/L 十六烷基三甲基溴化铵（pH=8.5） ；检测波长为 205 nm，分离电压为20 kV，温度为 25 。本方法有效地屏蔽了土壤溶液中 Cl，SO2和 NO3 等离子对 PO3测定的影响，对根际土壤溶液中 PO的检出限为 0.68 m
2、g/L（S/N=3） ； 回收率为87.2%99.4%，适于测定微量根际土壤溶液样品中 PO3的浓度。 【关键词】 PO；根际土壤溶液；毛细管电泳Abstract Analytical method of capillary zone electrophoresis with indirect UV detection was optimized and validated to determine the phosphate in rhizosphere soil solution samples.The effect of detection wavelength，electrolyte
3、composition，separation voltage and temperature were investigated.Analyses were performed in a 56 cm uncoated fused-silica capillary(length to the detector window) with reversed electroosmotic flow，anodic detection in 205 nm，separation voltage 20 kV，and temperature 25 .The electrolyte contained 32 mm
4、ol/L tris-hydroxymethyl-aminomethane，4 mmol/L 1,2,4-benzene-tricarboxylic trimellitic acid and 0.3 mmol/L tetradecyl-trimethylammonium bromide，pH 8.5.Under the conditions，the negative effect of the inorganic anion，such as Cl，SO4 and NO3，can be reduced on phosphate.The detection limit was 0.68 mg/L(S
5、/N=3)，and the recovery was 87.2%99.4%.The method has been applied to the determination of the concentration of phosphate in the rhizoshere soil solution.Keywords Phosphate；oil solution；apillary electrophoresis1 引言利用根箱抽提系统收集的原位根际土壤溶液中磷元素的动态变化研究可直接反映植物根系吸收磷的根际过程，对于理解磷的生物可利用性具有重要意义1。土壤根际中磷的研究过程，由于样品量很少
6、，且磷的浓度很低，限制了对根际土壤溶液中磷的测定，成为根际土壤溶液中磷研究的瓶颈2,3。毛细管电泳技术的微量进样和较高的分离效率优势使其在根际研究中占有重要地位。同时，紫外间接检测方法是检测无机离子的最普遍和有效的方法，被广泛应用4,5。但由于土壤溶液中PO3浓度远低于其它无机离子，且高浓度的 Cl，SO2，NO3等离子峰形的扩展，影响 PO3的出峰时间，增加了定性分析的难度6,7。本研究基于文献7测定土壤溶液 PO3的方法，对 PO3的检测波长、电解液的组成、电泳温度及电压等条件进行了选择，以减少离子干扰，满足原位根际土壤溶液样品中 PO3测定的需要。2 实验部分2.1 仪器与试剂毛细管电泳
7、仪（Agilent 3D CE，G1601 A，Germany） ， 包括安捷伦工作站 A.10.02，二极管阵列检测器（DAD） ； 熔融石英毛细管（内径50 m，总长度 64.5 cm，有效长度 56 cm，河北永年锐沣色谱器件有限公司） 。三羟甲基氨基甲烷（TRIS，99.0%） 、1,2,4-苯三酸（TMA，99.9%）和十六烷基三甲基溴化铵（TTAB，99.0%，美国 Sigma 公司； NaH2PO4（99.0%，美国 Fluka 公司） 。实验用水为 MilliQ 水（美国Millipore 公司） 。2.2 实验方法根据文献7中测定土壤溶液阴离子的方法（毛细管电泳仪：Beckm
8、an P/ACE 5510，CA，USA） ，以 PO3为目标离子，对检测波长、电泳温度、分离电压及电解液组成浓度等电泳条件进行选择。电解液经用 0.45 m 混合纤维膜过滤，实验前用超声波脱气 15 min。毛细管使用前，先用 1 mol/L NaOH 冲洗 30 min，电解液冲洗 10 min。在不进样的情况下电泳 5 次至毛细管壁平衡。每次测定样品后，用电解液冲洗 5 min，使管壁回复到相同的待测状态。采用压力进样法，进样时间 4 s，负极进样，正极检测，整个电泳分析过程由仪器自动完成。2.3 土壤根际溶液样品的制备用文献2建立的根箱抽提系统，分别将微型抽提管（Rhizosphere
9、 Research Products，Wageningen，Netherlands，外径为 1 mm，前端为多孔陶瓷 P80 材料，孔隙度 48%，最大孔径为 1 m）插入到植物根尖以上 3 cm 左右的根系周围土壤中。微型抽提管的后端则通过内径 0.75 mm 的聚醚醚酮管与真空收集器相连，在负压下将土壤溶液收集于聚丙烯瓶（200 L）中。根箱中分别种植喜旱莲子草和香蒲 2 种植物，每种植物的根际（距离根表1 mm）插 10 个微型抽提管，非根际（距离根表5 mm）插 5 个微型抽提管，在（302） kPa 的压力下连续收集 48 h，每个抽提点收集到的土壤溶液约为 100 L。3 结果和讨
10、论3.1 检测波长、温度和电压的选择根据毛细管电泳仪工作站的等吸收绘图确定 PO的最佳检测波长。检测波长为 205 nm 时，磷的信号峰的信噪比最大。因此，选择205 nm 作为检测波长。温度和电压条件可影响磷的出峰时间、峰面积和峰高。实验中保持毛细管电泳电解液（2 mmol/L TMA+8 mmol/L TRIS+0.3 mmol/L TTAB，pH=7.8）和电泳电压（30 kV）不变，改变电泳温度（10， 15， 20， 25 和 30 ） ，测定 5 mg/L PO3标准溶液。随温度升高，PO出峰时间变短，峰形越来越尖锐，25时峰面积达到最大（见表 1） 。然后再保持毛细管电泳电解液（
11、2 mmol/L TMA+8 mmol/L TRIS+0.3 mmol/L TTAB，pH=7.8）和电泳温度（25 ）不变，改变电泳电压（15， 20， 25 和30 kV） ， 测定 5 mg/L PO3标准溶液。随电压升高，PO3出峰时间变短，但同时峰面积变小，峰高基本不变（见表 2） 。综合考虑峰面积和出峰时间，电泳温度选择 25 ，电压选择20 kV。表 1 电泳温度对 PO的迁移时间、峰面积及峰高的影响（略）Table 1 Migration time， peak area and peak height of phosphate at different temperature表
12、 2 电泳电压对 PO的出峰时间、峰面积及峰高的影响（略）Table 2 Migration time， peak area and peak height of phosphate in different voltage3. 电解质溶液的影响由于阴离子迁移方向与电渗流（EOF）方向相反，阴离子出峰时间很长或无法检测，因此在分离缓冲体系中加入电渗流反向改性剂改变毛细管内壁电荷，从而使电渗流方向反转。TTAB 是一种常用的电渗流反向剂，一般选择浓度 0.3 mmol/L 时，分离时间比较合适8,9。TRIS 是一种弱碱，其缓冲 pH 值范围 7.59.0（25 ） 。当电压为20 kV，温度为
13、 25 ， TTAB 为 0.3 mmol/L， TMA 为 2 mmol/L， TRIS 浓度为 8，16 和 24 mmol/L 时，电解液 pH 值在 7.88.7 之间变化（表 3） 。H3PO4 的 pK2 为 7.2，随着 pH 升高，H2PO4 向 HPO2转化； pH 值越大，HPO2比例越大； 当 pH7.2 时，以 HPO2为主10。随着 pH 值的升高，谱图中 PO的峰形对称性越好，但基线越不稳定。pH=8.5 时的峰形和基线都较理想。表 3 不同浓度 TRIS 缓冲溶液对 PO3峰形的影响（略）Table 3 Effect of different concentrat
14、ion of TRIS buffer solution on phosphorus peakTRIS： Tris-hydroxymethylaminomethane.表 4 不同浓度 TMA 对基线噪声和 PO迁移时间的影响（略）Table 4 Effect of different concentration of 1,2,4-benzenetricarboxylic trimellitic acid(TMA) on base line and the migration time of phosphate保持 TTAB 浓度为 0.3 mmol/L，背景电解质分别选择 2，4 和 8 mm
15、ol/LTMA， pH 为 8.5（TRIS 浓度分别为 16，32 和 64 mmol/L） 。从表4 可见，TMA 浓度越大，PO3的迁移时间延后程度越小。这主要是因为检测方式采用的是间接紫外吸收方法，无紫外吸收特性的无机阴离子与背景电解液中的强紫外吸收物质 TMA 进行置换，改变了电解液的紫外吸收强度，形成倒立的信号峰11。当 TMA 浓度增大时，其对 Cl和SO2的容量越大，谱带展宽越小，这些非目标离子对 PO3出峰时间的影响就越小。然而，TMA 浓度增大的同时，背景电解液的噪声也逐渐增大，提高了 PO3的检出限。因而 TMA 浓度选择 4 mmol/L。3. 线性关系、重现性及回收率
16、在选定的条件下，用 6.4 mg/L PO3标准液重复进样 5 次，迁移时间的平均值为 5.77 min； 其 RSD 为 0.03%0.5%；峰面积的平均值为 9.68 mAUs， 其 RSD 为 0.2%0.7%； PO3浓度与其峰面积在0.425.6 mg/L 范围内呈线性关系，其线性回归方程为：A（mAUs）=1.478c+0.0514（r=0.9999） ，检出限为 0.5 mg/L。用香蒲根际土壤溶液与 12.8 mg/L PO3标准液按照体积比为11 混合制备加标样品，重复进样 5 次，迁移时间 RSD 为 0.7%2.5%；峰面积相对标准偏差为 0.8%1.6%； 加标样品的回
17、收率为87.2%99.4%； 样品检出限为 0.68 mg/L（S/N=3） ，可以满足样品的测定需求。图 1 PO标准溶液(a)和香蒲根际土壤试样(b)的电泳谱图（略）Fig.1 Electrophoregraph of standard phosphate and rhizosphere soil sample of cattail电泳条件(lectrode conditions)：毛细管(apillary): 56 cm m； 电解液(Buffer solution)： 0.3 mmol/L tetradecyltrimethylammonium bromide(TTAB) mmol/L
18、 TRIS-4 mmol/L TMA，pH 8.5；压力进样：50 kPa4 s； 电泳电压(Seperation voltage): 20 kV， 电泳温度(emperature): 25 ， 检测波长(Detection wavelength): 205 nm。3. 土壤溶液的测定采用本方法测定土壤根际溶液中的磷元素含量，每个样品测定 3次，每 3 个样品间插测 3 次 PO3标准溶液进行校正。PO3标准溶液和香蒲土壤溶液样品的电泳谱图见图 1。喜旱莲子草根际的土壤溶液PO3质量浓度（2.51.0） mg/L 显著低于香蒲根际（5.41.8） mg/L（p0.05） ，且均显著低于非根际土
19、壤溶液（11.82.4） mg/L（p0.05） 。【参考文献】1 Gttlein A，Hell U，Blasek R.Geoderma, 1996，69(1-2): 1471562 Gttlein A，Blasek R.Soil Science，1996，161（）: 7057153 Wang Z Y，Kelly J M，Kovar J L.J.Environ.Qual.，2004，33(4): 13871392 4 Valsecchi S M，Polesello S.J.Chromatogr.A，1999，834（-）: 3633855 Chang S Y，Tseng W L，Mallip
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