1、构建由缺氧反应元件修饰的 hTERT 核心启动子引导 FCY1 基因表达的复制缺陷型腺病毒作者：李立文 王臻 苏明权 马越云 于文彬 李哲 【关键词】 腺病毒科 关键词: 低氧;反应元件;转录靶向;端粒，末端转移酶;腺病毒科;遗传载体 摘 要:目的 构建由缺氧反应元件串联重复体修饰的人端粒酶逆转录酶（hTERT）核心启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶 FCY1 基因表达的复制缺陷型重组腺病毒. 方法 人工设计缺氧反应元件串联重复序列，克隆后插入 hTERT 启动子上游并经测序证实.将修饰后的 hTERT 启动子和酵母胞嘧啶脱氨酶基因 FCY1 插入穿梭质粒，与辅助质粒共转染 HEK293 细胞，重组产
2、生复制缺陷型腺病毒. 结果 获得了由 3 倍和 6 倍缺氧反应元件修饰的 hTERT 核心启动子引导 FCY1 基因表达的复制缺陷型重组腺病毒. 结论 基于 Cre 重组酶/loxP 的腺病毒载体构建系统操作简便、重组效率高. Keywords:anoxia;response elements;transcriptional target-ing;telomerase;adenoviridae;genetic vectors Abstract:AIM To construct replication-defective recombi-nant adenovirus with FCY1driv
3、en by multimer of hypoxia re-sponsive elements-modified hTERT core promoter.METHODS Multimer of hypoxia responsive elements were de-signed and cloned upstream to the hTERT core promoter，then confirmed by sequencing.The modified hTERT promot-er and FCY1were inserted into shuttle plasmids and cotrans-
4、fected HEK293cells with rescue plasmid pBHGlox（delta）E1，3Cre.RESULTS Recombinant adenoviruses with FCY1driven by three or six copies of hypoxia responsive elements-modified hTERT core promoter were constructed and ampli-fied.The titers of the resulting adenoviruses were8.41010 pfuL-1 and6.91010 pfuL
5、-1 ，respectively，as deter-mined by end-point dilution assay.CONCLUSION The ade-noviral vector construction kit based on Cre recombinase/loxP system can be easily and efficiently used in construction of replication-defective adenovirus. 0 引言 转录靶向已成为肿瘤基因治疗的热点1，2 .使用肿瘤特异性启动子或组织特异性启动子引导治疗基因在肿瘤组织中特异性的表达不
6、仅能有效治疗肿瘤，而且可以在最大程度上减轻基因治疗的毒副作用.目前研究证实，85%以上的人类肿瘤组织中均有端粒酶活性的上调，提示存在端粒酶逆转录酶启动子（hu-man telomerase reverse transcriptase，hTERT）的激活.已有使用该启动子对膀胱癌3 、肝细胞肝癌3 、骨肉瘤4 、胶质瘤5 等恶性肿瘤进行靶向转录基因治疗的报道.为了进一步提高该启动子在骨肉瘤组织中的表达特异性并增强其活性，根据实体瘤组织局部的缺氧微环境特点以及缺氧反应元件可使异源启动子获得在缺氧环境下可被激活的特性6-9 ，我们使用 Cre 重组酶/loxP 腺病毒构建系统成功构建了使用缺氧反应元
7、件串联重复序列修饰的 hTERT 启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶基因 FCY1 表达的重组腺病毒，为其在实体瘤治疗中的应用奠定了基础. 1 材料和方法 1.1 材料 HEK293 细胞系和 AdMax Kit D 购自 Microbix Biosystems Inc.（Canada）.pGL3-181hTERT10 由日本 Kanzawa 大学 Satoru Kyo 教授惠赠.pCI-neo-FCY111 由法国 Transgene 研究所Philippe Erbs 教授惠赠.T4DNA 连接酶、pGEM-T Easy Vector，Kpn，Xba，Sal，Xho，Mlu，Nhe，EcoR等限制性
8、内切酶以及 X-gal，ITPG，Taq DNA 聚合酶购自 Promega Corporation（USA）.CONCERT High Purity Plasmid Miniprep System，LipofectAMINE 等购自 Gibco BRL.Opti-CellTM 10mL100cm-2 培养板购自 Bio Crystal 公司.50bp DNA Ladder购自 MBI Fermentas 公司. 1.2 方法 1.2.1 缺氧反应元件串联重复序列的构建 人工设计内含 3 个小鼠磷酸甘油酸激酶 1 基因 5端缺氧反应元件（5-TGT CAC GTC CTG CAC GAC-3）
9、的 S84 寡核苷酸序列，其中 5端加入 Kpn，Xba，Sal酶切位点，3端加入 Xho和 Mlu酶切位点.同时以 S84 为模板设计引物，上游引物 PP1 为 5-GGT ACC TCT AGA GTC-3，下游引物 PP2 为 5-ACG CGT CTC GAG TG-3.S84，PP1，PP2 均由上海 Sangon 公司合成.以S84 为模板，PP1，PP2 为引物做 PCR 反应.循环参数为 9430s，5530s，7230s，32 个循环，最后延伸 10min.反应结束后在20gL-1 TAE 琼脂糖凝胶电泳上鉴定，用 QIAEXGel Extraction Kit 回收 DNA
10、 并插入 pGEM-T Easy Vector，转化 JM109 感受态细胞后进行蓝白筛选.挑取白色菌落，加入含 100mgL-1 氨苄青霉素的 LB 培养基 30mL，160rmin-1 摇菌，37过夜培养后提取质粒，用 Kpn和 Mlu进行双酶切鉴定.获得正确克隆后将 Kpn-Mlu片段插入 pGL3-181hTERT 获得 pGL3-3HRE-181hTERT.根据 Sal和Xho为同尾酶，将 pGL3-3HRE-181hTERT 的 Sal-Mlu双酶切片段插入pGL3-3HRE-181hTERT 的 Xho-Mlu双酶切载体，获得 pGL3-6HRE-181hTERT. 1.2.2
11、穿梭质粒的构建 将 pGL3-3HRE-181hTERT 和 pGL3-6HRE-181hTERT 的 Xba-Hind片段插入 pDC312，获得 pDC312-3HRE-181hTERT 和 pDC312-6HRE-181hTERT.然后根据 Nhe和 Xba为同尾酶将pCI-neo-FCY1 的 Nhe-EcoR片段插入 pDC312-3HRE-181hTERT 和pDC312-6HRE-181hTERT 获得 pDC312-3HRE-181hTERT-FCY1 和 pDC312-6HRE-181hTERT- FCY1.为了获得聚腺苷酸尾，以 Xba-EcoR双酶切将3HRE-181hT
12、ERT-FCY1 和 6HRE-181hTER-T-FCY1 插入以 Xba-EcoR双酶切反应切除 MCMV 启动子的 pDC316 载体上. 1.2.3 复制缺陷型腺病毒的重组 将 HEK293 细胞传入 OptiCellTM 10mL100cm-2 培养板，用含 100mLL-1 胎牛血清的高糖DMEM 在 37，50mLL-1 CO2 、饱和湿度条件下培养.用 CONCERT High Purity Plasmid Miniprep System 提取 pDC316-3HRE-181hTERT-FCY1，pDC316-6HRE-181hTE-RT-FCY1 和 pBHGlox（delt
13、a）E1，3Cre 质粒.待细胞达到 50%汇合时，使用 20L LipofectAMINE 将 10g pDC316-3HRE-181hTERT-FCY1 或 pDC316-6HRE-181hTERT-FCY1 质粒和 10g pBHGlox（delta）E1，3Cre 质粒共转染 HEK293 细胞.观察细胞病变.待50%的细胞出现典型病变反应时，收集细胞并重悬于 5mL PBS，-70，36反复冻融振荡 3 次，12000g 离心 5min，收集病毒上清，分装后置-70保存. 1.2.4 复制缺陷型腺病毒的扩增 待 HEK293 细胞达到 80%汇合时，每板加入 0.5mL 病毒粗提上清
14、，并以含 20mLL-1 胎牛血清的高糖 DMEM 在 37，50mLL-1 CO2 、饱和湿度条件下培养.待 50%的细胞出现病变反应时收集细胞，制备病毒粗提液. 1.2.5 复制缺陷型腺病毒的鉴定 根据 FCY1 基因序列（GeneBank access number:U55193）使用 Primer Premier 软件（Version5.0，PREMIER Biosoft Inc.）设计鉴定引物.上游引物 5-CTT ATC AAT AAC AAA GAC GGA AGT G-3，下游引物 5-TTG CCC TCT AAT CTC CCA CA-3，扩增片段长度为 122bp（291
15、-412）.循环参数为9460s，5560s，7260s，36 个循环，最后延伸 10min.模板制备方法:取 100L 病毒粗提液加入常规裂解液（0.2molL-1 NaOH，50mmolL-1 Triton X-100，50mmolL-1 Tween20，10mmolL-1 SDS） ，振荡混匀，100水浴20min，12000g 离心 10min，取上清作为模板.反应结束后在20gL-1 TAE 琼脂糖凝胶电泳上鉴定.阳性对照以回收的 pCI-neo-FCY1Nhe-EcoR片段为模板，以由 pFG140 转染 HEK293 细胞获得的复制缺陷型腺病毒粗提上清制备模板作为阴性对照. 1.
16、2.6 腺病毒滴度测定-终点稀释试验（End-Point Dilution Assay） 将 HEK293 细胞接种于 96 孔板上，接种密度为 1104 /孔.将病毒粗提液进行 10-1 10-10 系列稀释，每一稀释度占用一行，110孔加入稀释后病毒粗提液 100L，11，12 孔为对照.10d 后观察细胞病变反应，并以 Spearman-Karber 法计算病毒滴毒. 2 结果 2.1 缺氧反应元件串联重复序列的构建 经测序证实 pGL3-3HRE-181hTERT 和 pGL3-6HRE-181h-TERT 与设计相符（Fig1）. 图 1 图 2 2.3 Ad3HRE181hTERT
17、FCY1 和 Ad6HRE181hTERTFCY1 的鉴定 如 Fig3 所示，在 Ad-3HRE-181hTERT-FCY1 和 Ad-6HRE-181hTERT-FCY1 的粗提液中均成功扩增出 122bp 目标片段，而在阴性对照中则仅有引物二聚体.由于本研究中采用了 OptiCell 细胞培养系统，所有细胞都处于完 全封闭系统中培养，不会出现因空气传播而造成的交叉感染. 2.4 Ad3HRE181hTERTFCY1 和 Ad6HRE181hTERTFCY1 的滴度测定 终点稀释试验是用来测定腺病毒感染颗粒浓度的简单、精确方法.在本研究中 Ad-3HRE-181hTERT-FCY1 和 A
18、d-6HRE-181hTERT-FCY1 的滴度分别为 8.41010 pfuL-1 和 6.91010 pfuL-1 . 图 3 略 3 讨论 由于 hTERT 基因在肿瘤细胞中高度表达而在大多数正常组织中受到严格抑制，同时 hTERT 基因表达的调控主要在转录水平，所以 hTERT 启动子可以被用做肿瘤基因治疗的靶向转录启动子引导治疗基因表达，从而降低基因治疗对正常组织带来的毒副作用12-15 .Majumdar 等4 采用 hTERT 启动子控制人类单纯疱疹病毒胸苷激酶基因表达构建了腺病毒载体 hTERTp/TK，同时构建了人巨细胞病毒早期启动子引导HSV-TK 基因表达的腺病毒载体 C
19、MVp/TK，并将二者进行比较.在人骨肉瘤143B 移植瘤模型，两种载体一次注射继以丙氧鸟苷治疗可引起相同程度的肿瘤消退.注射 CMVp/TK 的动物在肿瘤组织和肝脏中均有胸苷激酶表达，丙氧鸟苷治疗可造成严重的肝组织病变和肝脏酶活性升高.而注射hTERTp/TK 的动物仅在肿瘤组织表达胸苷激酶，丙氧鸟苷治疗后其肝脏酶活性与正常健康鼠无明显差异，提示 hTERT 启动子可限制胸苷激酶在肿瘤组织表达，避免对正常组织和重要器官的不良效应. 使用 hTERT 启动子驱动凋亡基因或细胞毒性基因表达来治疗肿瘤中存在的主要问题是对干细胞的毒性.比较干细胞和实体肿瘤细胞微环境的特点，可以发现缺氧是其中的主要差
20、别之一，提示可以利用缺氧反应元件来对 hTERT 启动子进行修饰，从而进一步提高其肿瘤特异性.缺氧反应元件是存在于可被缺氧诱导或增强表达的基因中的保守 DNA 序列，其核心为 5-TACGTGC-3.已有研究证实采用缺氧反应元件对异源启动子进行修饰可使异源启动子获得缺氧诱导增强表达的能力16-19 ，亦有采用缺氧反应元件修饰异源核心启动子治疗肿瘤的研究20 ，但尚未见有使用缺氧反应元件串联重复体修饰 hTERT 核心启动子的转录靶向基因治疗肿瘤的报道. 综上所述，我们根据骨肉瘤的分子生物学特点和肿瘤局部微环境特点，设计并成功构建了由不同倍数缺氧反应元件串联重复序列修饰后的hTERT 核心启动子
21、引导酵母胞嘧啶脱氨酶基因 FCY1 表达的复制缺陷型重组腺病毒，然而其在体外和体内的肿瘤杀伤效应有待进一步研究. 参考文献: 1Harrington KJ，Linardakis E，Vile RG.Transriptional control:An essential component of cancer gene therapy strategies J?Adv Drug Deliv Rev，2000;44（1-2）:167-184. 2Nettelbeck DM，Jerome V，Luller R.Gene therapy:Designer promoters for tumor tar
22、geting J.Trends Genet，2000;16（4）:174-181. 3Abdul-Ghani R，Ohana P，Matouk I，Ayesh S，Ayesh B，Laster M，Bibi O，Giladi H，Molnar-Kimber K，Sughayer MA，de Groot N，Hochberg A.Use of transcriptional regulatory se-quences of telomerase（hTER and hTERT）for selective killing of cancer cells J.Mol Ther，2000;2（6）:53
23、9-544. 4 Majumdar AS，Hughes DE，Lichtsteiner SP，Wang Z， Lebkowski JS，Vasserot AP.The telemerase reverse transcrip-tase promoter drives efficacious tumor suicide gene therapy while preventing hepatotoxicity encountered with constitutive promot-ers J.Gene Ther，2001;8（7）:568-578. 5Komata T，Kondo Y，Kanza
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25、promoter J.Cancer Res，2001;61（15）:5796-5802. 6Brown JM.The hypoxia cell:A target for selective cancer ther-apy J.Cancer Res，1999;59（23）:5863-5870. 7Hockel M，Vaupel P.Tumor hypoxia:Difinitions and current clinical biologic，and molecular aspects J.J Natl Cancer Inst，2001;93（4）:266-276. 8Williams KJ，Co
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