1、固相萃取 高效液相色谱 荧光检测土壤中喹诺酮类抗生素作者：邰义萍 莫测辉 李彦文 包艳萍 张艳 姚圆 罗晓栋 【摘要】 建立了固相萃取 高效液相色谱 荧光(HPLCFLD) 检测土壤中 4 种喹诺酮类抗生素的分析方法。样品采用 50% Mg(NO3)210% NH3H2O（964，V/V）超声提取，过 HLB 柱富集净化，再用乙腈0.067 mol/L H3PO4 溶液洗脱。采用高效液相色谱 荧光检测器，以乙腈0.067 mol/L H3PO4(用三乙胺调节至 pH 2.5)为流动相，于激发波长280 nm、发射波长 450 nm 处进行检测。土壤样品中 4 种喹诺酮类抗生素的加标回收率在 6
2、0.4%99.3%之间，检出限为 0.581.0 g/kg。对蔬菜基地土壤样品分析结果表明，本方法能够满足实际样品的分析要求，4种喹诺酮类抗生素均被检出，土壤中抗生素污染问题值得关注。 【关键词】 土壤， 喹诺酮类抗生素， 固相萃取， 高效液相色谱， 荧光检测1 引言喹诺酮类抗生素(QNs)大量用于人类和动物医疗，还添加于饲料中以提高饲料利用率和促进动物生长1,2。抗生素摄入后大部分（85%）以原药和代谢产物的形式随粪尿排出体外1，成为新的环境污染物，并以多种途径进入土壤。其中人用抗生素在城市污水中的浓度高达 10 g/L3，在污水处理过程中其去除率通常较低4，导致大量抗生素进入地表水，造成河
3、流抗生素污染5，并通过灌溉水进入农业土壤6。规模化养殖场畜禽废物（粪尿）中抗生素的浓度高达0.010.1 g/kg 水平7，并作为有机肥广泛用于农业生产，每年由此输入土壤中抗生素的数量甚至不亚于农药，从而导致土壤抗生素污染，并引发水体污染，产生耐药性，危及生态安全和人体健康8，。近年来，喹诺酮类抗生素在水体、土壤和畜禽废物中被普遍检出，10，但在环境中主要以痕量存在，在水体中含量通常为 108g/L水平1，在养殖场附近底泥中含量可达 104g/kg 水平。目前，主要采用液相色谱 质谱联用(HPLCMS) 分析环境中喹诺酮类抗生素，1，。因仪器昂贵而难以普及，且主要是针对水体进行分析。虽然肉奶蛋
4、等动物性食品中抗生素残留的高效液相色谱分析方法已成熟且有相关标准，但由于土壤与动物性食品间的性质差异很大，且土壤中杂质更为复杂。因此，不能直接采用食品中的提取净化方法来分析土壤中的抗生素。目前，利用高效液相色谱仪分析土壤中喹诺酮类抗生素的报道很少，检测的化合物种类少，或是以灵敏度欠佳的紫外光来进行检测。为此，本研究建立了有效价廉的高效液相色谱 荧光同时测定土壤中 4 种喹诺酮类抗生素的分析方法。2 实验部分2.1 仪器与试剂高效液相色谱仪（日本岛津公司） ；SHZ82 恒温震荡器；KQ250E超声波清洗器；24 管固相萃取装置；HLB 固相萃取柱(3 mL， 60 mg） ，Supelco 公
5、司)；C18 固相萃取柱(3 mL， 500 mg） ，Supelco 公司)；雷磁PHS3C 精密 pH 计；氮吹仪。4 种喹诺酮类抗生素：诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)、洛美沙星(LOM)和恩诺沙星(ENR)， （纯度98.0%，德国r. Ehrenstorfer 公司） 。甲醇和乙腈（色谱纯，Sigma 公司） ；其余试剂均为分析纯；实验用水为高纯水。标准品母液：准确称取 4 种喹诺酮类抗生素标准品各 0.0100 g, 溶入 0.05 mol/L NaOH 溶液，并用高纯水稀释定容至 100 mL，配制成浓度为 100 mg/L 的工作母液，在 4 下避光保存。50% Mg(N
6、O3)2 溶液：称取 50g Mg(NO3)26H2O 溶于 100 mL 高纯水，室温保存。 10% NH3H2O将的氨水用水稀释部，现配现用。0.067 mol/L H3PO4/三乙胺溶液(pH 2.5)：取 5 mL H3PO4，加高纯水稀释至 1000 mL，滴加三乙胺调 pH 至 2.5。2.2 样品预处理称取 1.00 g 粉碎后风干过 0.30 mm 孔径筛的土壤样品于 10 mL 离心管中，加入 50%Mg(NO3)210% NH3H2O（964， V/V） 5 mL，振荡 5 min，超声提取 15 min，离心（4500 r/min） 5 min，收集上清液。残渣再用上述方
7、法反复提取 2 次。合并提取液，过 HLB 固相萃取小柱（小柱先后用 6 mL 甲醇、6 mL 水进行预处理）萃取富集。用 6 mL 高纯水清洗小柱，真空干燥 10 min，再用 3 mL 乙腈H3PO4 溶液(51， V/V)洗脱小柱。洗脱液在 40 水浴下用氮气吹至近干，用流动相定容至 1 mL，溶液过 0.22 m 膜，收集滤液于样品瓶中待测。2.3 色谱条件Waters 色谱柱(250 mm4.6 mm， 5 m)；激发波长 280 nm，发射波长 450 nm；柱温 25 ；进样量 20 L；流动相：乙腈0.067 mol/L H3PO4 溶液(1585，V/V)； 流速：1.0 m
8、L/min。3 结果与讨论3.1 色谱条件的确定喹诺酮类抗生素能够产生荧光，可采用荧光检测器进行定量分析。结合其最大吸收波长，实验确定了激发波长为 280 nm，发射波长为 450 nm。喹诺酮类抗生素结构中游离羧基及碱性氮原子的解离会造成色谱峰拖尾严重和保留值不稳定等问题1。因此，采用 H3PO4 溶液作为离子抑制剂，加入三乙胺（调节 pH 2.5）以消除出峰脱尾现象。实验确定了乙腈0.067 mol/L H3PO4(1585, V/V) 溶液为流动相，可获得 4 种喹诺酮类抗生素标准溶液理想的色谱分离图标样（0.5 mol/L） 、土壤和加标土壤中 4 种喹诺酮类抗生素的色谱分离图见图 1
9、，且出峰时间较短(图2b)。图 1 4 种喹诺酮类抗生素的 HPLC 分离图（略）Fig.1 Chromatograms for the separation of four quinolone antibiotics（QNs）a. 0.5 mg/L 标样（tandards solution） ； b. 土壤（oil sample）; c. 加标土壤（piked soil sample，0.5 mg/L)。1. 诺氟沙星(Norfloxacin, NOR)； 2. 环丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)； 3. 洛美沙星(Lomefloxacin, LOM)； 4. 恩诺沙星(Enr
10、ofloxacin, ENR).3.2 提取条件的优化3.2.1 提取液的筛选 喹诺酮类抗生素的极性结构决定了其可溶于有机溶剂和碱性水溶液，且弱碱性时能与 Mg2+形成稳定的螯合物。因此，选取两种极性有机溶剂的碱性溶液 10%乙腈NH3H2O和 10%丙酮NH3H2O ，以及 50% Mg(NO3)2 溶液和 50% Mg(NO3)22% NH3H2O(964, V/V)4 种提取液各 5 mL，分别对 1.00 g 加标（0.5 g/g）土壤样品中 4 种喹诺酮类抗生素进行超声提取（30 min） ，获得4 种喹诺酮类抗生素的回收率见图 3。可以看出，50% Mg(NO3)22% NH3H2
11、O（964，V/V）对土壤中 4 种喹诺酮类抗生素的提取效果均较理想（58.7%79.1%） 。实验进一步考察该提取液添加不同浓度 NH3H2O对提取效果的影响（图 4） ，可以看出，NH3H2O 浓度为 10%时 4 种喹诺酮类抗生素的回收率达 69.2%82.0%。因此，选择 50% Mg(NO3)210% NH3H2O（964，V/V）作为提取液。3.2 提取液用量的确定 提取液用量会影响喹诺酮类抗生素的提取效果。用量太少造成提取不完全；太多则会提取更多杂质。当提取液用量为 4 mL 时，4 种喹诺酮类抗生素的回收率均在 70%以上（70.2%85.0%） ，高于 2 mL（62.6%7
12、7.9%） ， 3 mL（61.8%67.8%）和 5 mL（69.4%80.1%）的回收率。因此，选择 1 g 土壤样品用 4 mL 提取液进行提取。图 2 流动相中 H3PO4 溶液不同配比对喹诺酮类抗生素出峰的影响（略）Fig.2 Effect of mobile phase with different volume of phosphoric acid on separation of quinolone antibioticsa. 乙腈(cetonitrile)H3PO4 溶液(Solution)=1783, V/V； b. 乙腈(cetonitrile)H3PO4 溶液(Solu
13、tion)=1585, V/V； c. 乙腈(cetonitrile)H3PO4 溶液(Solution)=1387， V/V。 1. 诺氟沙星(Norfloxacin)； 2. 环丙沙星(Ciprofloxacin)； 3. 洛美沙星(Lomefloxacin)； 4. 恩诺沙星(Enrofloxacin)。图 3 不同提取液对喹诺酮类抗生素的回收率（略）Fig.3 Recovery of quinolone antibiotics in soil with various extractions10%乙腈(Acetonitrile)NH3H2O ； 10%丙酮(Acetone)NH3H2O
14、 ； 50% Mg(NO3)2； 50% Mg(NO3)22% NH3H2O(964, V/V)图 4 提取液中添加不同浓度 NH3H2O 对回收率的影响（略）Fig.4 Effect of various concentrations of ammonia added to extraction on recovery of quinolone antibiotics3.3 超声提取时间的选择 不同超声提取时间对喹诺酮类抗生素的回收率也有较大影响。 图 5 超声提取时间对喹诺酮类抗生素回收率的影响（略）Fig.5 Effect of ultrasonicextraction time on
15、recovery of quinolones图 5 是不同超声提取时间对土壤中 4 种喹诺酮类抗生素的提取效果。超声提取时间为 15 min 时，4 种喹诺酮类抗生素的回收率均最高。3. 不同萃取方式对回收率的影响比较了液 液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）对喹诺酮类抗生素的富集效果。LLE 采用三氯甲烷为萃取液，SPE 选用两种固相萃取小柱 HLB和 C18，其回收率见表 1。三氯甲烷液相萃取和 C18 固相萃取对 4 种喹诺酮类抗生素的回收率均不佳。HLB 柱固相萃取对 4 种 QNs 的回收率较高，且操作过程简便，能够避免萃取过程中出现干涸。因此，选择 HLB 固相萃取小柱对土壤样品进
16、行预处理。3.4 不同洗脱液及其用量的选择实验比较了甲醇、乙腈以及乙腈0.067 mol/L H3PO4 作为洗脱液的回收率。结果表明，不同洗脱液的回收率依次为： 乙腈0.067 mol/L H3PO4（51, V/V）甲醇乙腈。分 5 次洗脱，每次 1 mL，分段收集洗脱剂测定回收率，乙腈H3PO4 体系的淋洗曲线如图 6。由图 6 可见，第 3 次洗脱回收率已基本稳定，因此选择洗脱液用量为 3 mL。 图 6 洗脱液不同用量对回收率的影响（略）Fig.6 Recovery of QNs using different dosage of elution solution表 1 不同萃取方式
17、对喹诺酮类抗生素的回收率（略）Table 1 Recovery of quinolones treated with different extraction method3. 线性范围、检出限、回收率和精密度将标准品母液用高纯水稀释成0.002，0.005，0.01，0.02，0.05，0.10，0.20 和 0.50 mg/L 的混合标准工作液。在上述色谱条件下进样，得到 4 种喹诺酮类抗生素浓度（y）与峰面积（x）的线性关系，相关系数 r0.99。以 10 倍信噪比求得 4种喹诺酮类抗生素的仪器检出限和土壤样品定量限（表 2） ，比文献4,6报道的低 12 个数量级。在土壤样品中添加不同
18、浓度的喹诺酮类抗生素混合标准溶液，进行加标回收实验，获得回收率及相对标准偏差，结果见表 3。为进一步确认方法的可靠性，在 1.00 g 土壤中添加喹诺酮类抗生素（0.5 mg/L）进行不同批次各 3 个重复的预处理与分析，批间平均回收率在 67.7%92.3%之间； 批内标准偏差低于 3%； 批间标准偏差低于 5%（表 4） ，表明本方法的准确度和精密度均符合样品分析要求。表 2 四种喹诺酮的线性关系、相关系数和检出限（略）Table 2 Regression analysis of calibration curves and quantification limits for 4 quin
19、olone antibiotics表 3 土壤中 4 种喹诺酮的加标回收率(%)及相对标准偏差（略）Table 3 Recovery and RSD（%）of 4 quinolone antibiotics in soil(n=3)表 4 不同批次分析加标(0.5 g/g)土壤中回收率(%)及相对标准偏差（略）Table 4 Recovery and RSD（%）of 4 quinolone antibiotics in soil of three batches(n=3)3. 土壤样品的测定利用上述所建立的分析方法，对广州市某蔬菜基地 6 个土壤样品中4 种喹诺酮类抗生素进行了分析。结果表明
20、，土壤样品中均检出 4 种喹诺酮类抗生素，总含量在 27.8129.3 g/kg 之间。其中诺氟沙星为14.964.4 g/kg， 环丙沙星为 54.6731.5 g/kg， 恩诺沙星为5.1340.2 g/kg， 洛美沙星为 0.876.84 g/kg。环丙沙星的含量明显低于直接用畜禽排泄物施肥或用污水灌溉的土壤，。【参考文献】 Hartmann A , Alder A C , Koller T. Environmental Toxicology and Chemistry, 1998, 17(3): 3773822 Li YanWen( 李彦文), Mo CeHui( 莫测辉), Zhao
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