1、光动力学疗法对肿瘤细胞信号传导通路作用的研究进展【摘要】 本文通过综述光动力作用对肿瘤细胞信号传导通路影响的研究成果，进一步分析光动力作用抗肿瘤治疗的可能作用机理，对光动力作用的多种可能作用机制深入进行探讨。 【关键词】 光动力疗法；肿瘤；信号传导光动力学疗法（photodynamic therapy，PDT） ，又被称为光辐照疗法（photoradiation therapy）或光化学疗法（photochemotherapy） 。该方法是利用光敏剂分子接受特定波长的光能后通过光化学反应和能量传递过程将光能转化为分子内能，在有氧条件下，产生多种活性氧物质（ractive oxygen spec
2、ies，ROS） ，包括单线态氧（1O2） 、氧自由基、羟自由基、过氧化氢等，从而对蛋白质、核酸和脂类大分子产生破坏作用，使细胞的结构和功能受到严重影响，导致细胞凋亡或死亡，而起到治疗作用。该作用有两种类型：一种是光敏剂通过电子或质子（e 或H+）的转移引起自由基的氧化还原反应，称为型光动力反应；另一种是光敏剂将能量传递给周围的氧分子使其成为单线态氧，称为型光动力反应。PDT 因其能相对特异地选择性杀伤肿瘤细胞，对健康组织损伤小，很少发生并发症以及毒副反应小等优点，使其成为一项非常有前途的肿瘤治疗方法。PDT 作用的效果与所用光敏剂类型、照射条件、组织氧代谢状态、细胞类型有关，其中光敏剂在细胞
3、内的结合位点因为决定了 PDT的最初损伤部位而最为重要1 。细胞信号传导几乎涵盖了所有的生命现象，是生物体具有的一种十分重要的生理功能。细胞信号传导的异常变化在细胞癌变过程中起着十分重要的作用，信号传导系统的缺陷和异常活化与肿瘤发生、发展及预后的关系已成为肿瘤分子生物学研究热点，同时通过调控信号传导途径治疗肿瘤也成为人们日益关注的焦点2 。多年前人们研究就发现，PDT不仅能导致细胞凋亡或死亡，还能激发细胞产生逃避反应。细胞在亚致死剂量的物理或化学因素作用下产生的逃避反应会导致相关基因和应激蛋白的表达变化，并从而逃避打击3 。PDT 等外界刺激因素作用后会导致细胞多种信号传导系统产生变化，例如磷
4、酸化与去磷酸化，钙离子或cAMP 等第二信使活性的改变，蛋白酶的激活等。同时，PDT 还可以改变粘附因子、细胞因子4的表达。尽管已经有不少相关研究，但 PDT 对细胞信号传导系统产生影响的作用机制尚不清楚。同时许多都是体外实验，在体实验有待进一步研究，多种实验模型和光敏剂的使用使问题显得更为复杂。本文拟就 PDT 对肿瘤细胞信号传导影响的研究进展作一综述，主要讨论 PDT 对细胞诱导死亡或产生逃避反应的影响，这其中，光敏剂在细胞中的位置、细胞的类型、光动力作用的剂量都有重要的作用。1 线粒体许多脂溶性光敏剂结合并作用于线粒体膜，如酞菁 Pc4、苯并卟啉衍生物单酸环 A（BPDMA ）等，它们在
5、多种疾病中的应用得到广泛研究。多种光敏剂被发现与线粒体膜上的苯二氮卓受体有高亲和力。Kessel D等报道，光敏剂定位于线粒体膜比定位于溶酶体膜或其它浆膜更快的导致细胞凋亡5 。其机制已部分被人们了解。当光敏剂结合于线粒体膜，PDT 会激活特定的信号传导通路，首先是细胞色素 c 从线粒体进入胞浆。Date M 等6报道，PADS31 介导 PDT 对人肝癌细胞作用后，可以立刻观察到细胞色素 c 进入胞浆。同样的结果也在 SiPc 介导 PDT 对人黑色素瘤细胞作用或 5ALA 介导 PDT 对 HL60 白血病细胞作用后观察到。这些光敏剂都定位在线粒体膜。研究还发现，PDT 能导致线粒体膜电位
6、的降低，这可能与线粒体渗透转运大通道的开放有关。线粒体渗透转运大通道的开放导致线粒体膜去极化，引起 Ca2+的释放以及细胞色素 c 的丢失7 。但目前这种通道尚未能完全为人们了解，细胞色素 c 的释放机制以及它与线粒体膜电位的关系也尚需进一步研究。PDT 作用以后细胞色素 c 进入胞浆会导致多种后果。Varnes 等观察到加入外源性细胞色素 c 能够逆转 Pc4 介导 PDT 作用对细胞呼吸的抑制作用。表明 PDT 主要作用于线粒体膜而对呼吸链的主要组成没有损伤，能通过 ATP 减少导致细胞坏死，也能通过激活半胱天冬酶（caspase）途径导致细胞凋亡。释放出的细胞色素 c 能形成 dATP、
7、凋亡激活因子1（APAF1 ）以及前半胱天冬酶 9 的复合体，它能促使前半胱天冬酶 9的激活并最终导致前半胱天冬酶 3 的激活8 。半胱天冬酶 3 是细胞凋亡过程的关键酶，和大量其它蛋白的释放有关，如 DNA 断裂因子。因为人黑色素瘤细胞在 SiPc 介导 PDT 作用后的主要死亡模式是凋亡，Barge J 推断，细胞色素 c 的流失是这个过程的关键启动因子。这与 Granville的研究结果是一致的，细胞色素 c 的释放导致caspase3，caspase6，caspase7 等多种半胱天冬酶的激活。此外，Barge J 还发现了 caspase8 的延迟激活，而 caspase8 与 CD
8、95/FAS 介导的独立的凋亡途径有关。Takahashi H 也报道9 ，ATXS10 介导 PDT 对 NHK细胞作用后，可以观察到细胞色素 c 的释放以及随之 caspases9/3/6 和caspases8/3/6 两个半胱天冬酶级联的激活。在凋亡过程中，caspases3 激活导致许多与维持细胞正常结构和功能的蛋白因子结构被破坏。如 QLT0074 介导 PDT 作用导致人角质化细胞多聚腺苷酸聚合酶（PARP）的断裂。PARP 是一种将多聚二磷酸腺苷转运给组氨酸和其它核蛋白，有助 DNA 修复的酶，它的结构被破坏将导致功能丧失并最终导致细胞的死亡。尽管半胱天冬酶调节的凋亡过程是 PD
9、T 导致细胞死亡的主要模式，但并不是不可替代的。Xue LY 等10研究发现，在 Pc4 介导 PDT 对转染有 caspase3 基因的 MCF7c3 细胞和无caspase3 表达的 MCF7 细胞的作用中，都观察到了细胞色素 c 从线粒体中释放，但只在 MCF7c3 细胞中看到 caspase3 和 PARP 的表达。同时 MCF7c3细胞在 PDT 作用后 6 小时就可以观察到 DNA 碎片的出现，而 MCF7 细胞则在 PDT 作用后 20 小时才看到 DNA 的大碎片，其凋亡的程度也远小于MCF7c3 细胞。MCF7c3 细胞较 MCF7 细胞对光敏作用更敏感，但是两种细胞在克隆试
10、验中却对光动力杀伤有相同的敏感性。研究表明，Pc4 介导PDT 作用中，从最初的线粒体损伤到细胞死亡是一个很快的过程，caspase3 介导的凋亡过程与这种致死的实验模式可能不相关。Bcl2 蛋白位于线粒体膜、内质网膜和核膜上，是抗凋亡蛋白的一种，对调节许多细胞抗凋亡诱导的敏感性有重要的作用。许多人对通过结合于线粒体膜的光敏剂介导的 PDT 作用中 Bcl2 及相类似蛋白的调节作用进行了研究。Vantieghem A 等11研究发现，在血卟啉介导 PDT作用过程中，Bcl2 的表达能显著抑制细胞色素 c 的释放，caspase3 的激活以及 PARP 的破坏，减少细胞凋亡，但不能减少 PDT
11、导致的细胞坏死。在 PDT 介导的凋亡过程中，表达 Bcl2 的细胞存在有 caspase 依赖的细胞色素 c 释放相关的反馈调节机制。BclxL 蛋白与 Bcl2 蛋白类似，位于线粒体膜，能够调节细胞色素 c 的释放从而对 PDT 诱导的凋亡有调节作用。目前，尽管人们对线粒体进行了更多研究，但有关光敏剂与线粒体膜相结合后导致细胞色素 c 释放的机制仍未能完全阐清。可能的机制是细胞色素 c 的释放导致 caspase9 和 caspase3 的相应级联反应并最终导致凋亡发生，而 Bcl2 蛋白家族通过影响细胞色素 c 的释放调节这一过程。 凋亡与细胞彻底死亡之间也尚有许多不清楚的地方，这可能与
12、我们过于依赖一些简单的短期实验有关，染料排斥、线粒体活力下降等细胞部份功能的丧失可能在短期实验中给了我们细胞活力丧失的结论。Xue LY 的研究提示我们在检测细胞死亡的实验中采用细胞克隆试验对检测细胞活力更为可靠，这需要我们改进实验方法进一步研究。2 质膜脂溶性的光敏剂最主要的结合位置就是质膜，这也使质膜成为 PDT作用的重要目标。同时许多信号传导通路也是由质膜开始的，因而质膜是 PDT 干预细胞信号传导系统的重要作用部位。很早就有研究发现，PDT 作用以后能迅速激活磷脂酶 C（PLC）和磷脂酶 A2（PLA2） 。这两种膜结合蛋白酶的激活和细胞的许多信号传导过程有关。近期研究发现，PDT 能
13、通过 PLC 激活以及随后的三磷酸肌醇（IP3）合成导致细胞内 Ca2+浓度升高12 。Ca2+浓度升高也可导致PLA2 的激活，而 PLA2 的激活被证明与 PDT 作用后的凋亡发生相关。Hsieh YJ 等13报道，血卟啉在 A341 细胞主要结合于质膜及高尔基体膜，PDT 作用后能促使多种信号通路激活，包括活性氧物质的迅速形成，CJun 氨基末端激酶的激活，caspase3 的延迟激活及 PRAP 的断裂，线粒体膜电位的丧失等。其中，作者认为活性氧物质的形成最为重要。对于 PDT 作用于质膜，人们也有不同的报道，Kessel D14报道，在PDT 治疗中，当 PDT 作用直接作用于亚细胞
14、结构时会广泛产生细胞凋亡，当细胞质膜为 PDT 作用的主要目标时，会因为 caspase3 选择性的被光敏作用损伤导致凋亡的延迟。3 蛋白激酶磷酸化是蛋白翻译后调节的重要方式，蛋白激酶的磷酸化与去磷酸化在信号传导通路的调节中广泛存在。目前有关光动力作用以后信号传导通路中关键信号蛋白激酶磷酸化只有少数几个通路得到了研究。目前研究较多的信号放大途径是通过生长因子介导的有丝分裂原途径。配体与生长因子受体的结合导致细胞内丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中细胞外信号调节激酶（ERK）的激活，产生有丝分裂或不同的结果。EGFR 与细胞生长和细胞周期的调节有关，属于受体酪氨酸激酶家族，在配体激活后能自动磷
15、酸化。Ahmad N 等15报道，在 Pc4 介导 PDT 对人皮肤癌细胞（A341）的体内治疗实验中，观察到表皮生长因子受体（EGFR）蛋白表达受到抑制的同时，却可以观察到 EGFR 的酪氨酸磷酸化。作者从而推测，EGFR 抑制剂能够提高光动力作用的疗效。在Pc4 介导光动力对 A431 细胞作用中，当细胞存活率小于 1%时，表皮生长因子刺激磷酸化的作用被完全阻断。但是，大剂量 PDT 作用时，由于其它许多非特异因素的作用，上述研究发现对凋亡产生的作用尚不完全清楚。在有丝分裂原途径中有关 ERK 的研究有不同的报道。Assefa 发现PDT 能不可逆的抑制 EGF 诱导的 ER激活。而 To
16、ng Z 等16报道，多种肿瘤细胞在 PDT 作用后，均可以观察到 MAPK 家族中 ERKs 的激活表达，使用 MAPK 或 ERK 抑制剂可以显著降低光动力作用后肿瘤细胞的存活率。研究发现 PDT 作用还可以诱导细胞内丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶（MKP1 ）的表达，其表达与 ERK 的激活表达相关。实验结果表明，肿瘤细胞在光动力作用后 ERK 的激活可以减轻光毒性作用，ERK 的激活表达受 MKP1 调节。也有发现 PDT 对 ERK 没有影响。Tao 等报道，BPD 介导PDT 对 PAM212 细胞作用中，对 ERK 活性没有影响。人们对 MAPK 信号途径的激活进行了更多的研究，在相同
17、条件下，PDT 往往能够激活应激激活蛋白激酶（SAPK）/CJun 氨基末端激酶（JNK）和 p38/HOG1 通路。SAPK/JNK 和 p38/HOG1 在细胞对包括单态氧在内的外界刺激的应激反应中有重要作用。不论是通过 cjun 或是Bcl2 的磷酸化，多种实验模型发现 SAPK/JNK 通路与凋亡诱导有关。Tong Z 等17报道血卟啉衍生物介导 PDT 作用 30 分钟，人成纤维细胞即可出现 JNK1 及 P38 的激活表达，并能持续 3 小时，同时细胞存活率升高。而用表达显性负性突变 p38 的腺病毒进行转染的人成纤维细胞及Hela 细胞则在 PDT 作用后细胞存活率下降。Asse
18、fa Z 等研究了 PDT 作用中 SAPK/JNK 激活对凋亡诱导的影响。通过对 Hela 转染 SAPK 显性负性抑制因子 SEKAL 和 TAM67 ，或使用 p38 通路特异抑制剂 PD169316，PDT的光敏感作用显著提高。作者因而总结在血卟啉介导 PDT 作用中，SAPK/JNK 和 p38 通路的激活对 Hela 细胞有抗凋亡的保护作用。Hendrickx N 等18报道在血卟啉衍生物介导光动力抗肿瘤作用中，可以观察到肿瘤细胞内丝裂原活化蛋白激酶 p38 MAPK 通路的选择性激活，下游环氧化酶 2（COX2 ）在 mRNA 及蛋白水平的表达上调，以及前列腺素 E2（PGE2）
19、的释放表达。P38 MAPK 通路抑制剂 PD169316 能抑制 PGE2的表达；p38 MAPK 通路的激活及过度表达能够提高肿瘤细胞对光动力诱导调亡的耐受能力，提示 PDT 作用及 p38 MAPK 通路抑制剂的联合应用可以通过相应信号通路的阻断，抑制促肿瘤细胞及血管相关生长因子的释放，促进肿瘤细胞凋亡，提高抗肿瘤治疗效果。5ALA 介导 PDT 对皮肤癌细胞的治疗中也发现 JNK 活性的明显升高以及 p38MAPK 的磷酸化。与此相反，Xue L 等报道，在 Pc4 介导 PDT 中使用 p38/HOG 通路特异抑制剂SB202190 能减少 L5178YR 细胞的凋亡。这种反应的不同
20、可能与使用不同的细胞株、光敏剂和 PDT 损伤水平有关。SAPK/JNK 通路的上游调节因子尚不清楚。现在发现的一个可能的活性调节因子是神经酰胺。但目前在 PDT 诱导的凋亡中，SAPK/JNK 通路激活的作用尚不清楚。在实验模型中，PDT 诱导凋亡是一个快速的过程，SAPK/JNK 通路的激活可能没有相关。目前，与 PDT 诱导凋亡相关的通路尚未完全建立。在 Pc4 介导 PDT 对人前列腺癌 LnCAP 细胞作用中，发现胞浆酪氨酸蛋白激酶 Etk/Bmx 的表达对细胞凋亡有抑制作用。酪氨酸激酶 Etk/Bmx是磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）的作用底物，与涉及细胞分化及生存的多个信号传导通路
21、有关。三种相关细胞株进行了对比试验：表达低水平 Etk的 LNCaP 细胞，高表达转染野生型 Etk 的 LNCaP 细胞以及转染显性负性表达 Etk 的 LNCaP 细胞。发现光敏作用与 Etk 表达水平负相关，表明 Etk在 PDT 诱导凋亡中对 LNCaP 细胞有保护作用，能降低细胞凋亡率，并且Etk 活性受 PI3K 调节，而加入 PI3 抑制剂能增加 DNA 的断裂。 。显然，即使如 Pc4 介导 PDT 作用中所发现，凋亡直接因线粒体损伤诱导，也同样有其它和凋亡有关的信号传导通路的存在。Zhuang S 等19报道，PDT作用所产生单态氧是诱导细胞凋亡的主要因素。同时还发现，PDT
22、 作用产生的其它细胞毒性活性氧物质如过氧化氢等在引起细胞死亡的同时还会刺激细胞生存相关的信号传导通路的激活，可以通过受体型酪氨酸蛋白激酶的激活可以激活 Akt/蛋白激酶 B 信号传导通路促进细胞生存。进一步还发现其是由 PI3 激酶激活所致，抑制 PI3 激酶可以完全阻断 Akt 的磷酸化，并提高 PDT 作用后单态氧所导致的细胞死亡率。此外，Games ER 等20报道，肿瘤细胞在铝钛菁介导 PDT 作用后，可以观察到 NO 的表达增加，而 NO 对肿瘤细胞抗光动力效应具有保护作用。实验发现，在肿瘤细胞培养体系中加入 NO 可以提高 PDT 作用后的细胞存活率。进一步实验研究发现，这种保护作用与 cGMP 信号传导通路的激活相关，蛋白激酶 G（PKG）抑制剂能够阻断 PDT 作用后 NO 对肿瘤细胞的保护作用。实验结果表明，肿瘤细胞在光动力作用后可能通过 PKG 激活导致 NO 产生增多，从而可以减少凋亡发生。Jiang F 等报道，在光动力抗肿瘤治疗中，在不同的血卟啉衍生物浓度、不同的光照能量密度条件下，蛋白激酶 C（PKC）抑制剂均可以明显提高光动力效应的细胞毒性作用。如上所述，PDT 能够改变一些重要调节蛋白的磷酸化水平，但是引发
