1、广东巨大儿发病率调查及高危因素分析【关键词】 广东 巨大儿发病率 高危因素A:Immunohistochemical staining with antiinsulin antibody of islet grafts in MSC group on day 15 after transplantation; B:Immunohistochemical staining with antiinsulin antibody of islet grafts in control group on day 15 after transplantation;C: Immunohistochemical
2、 staining with anti-CD40LIg antibody of islet grafts in MSC infected with CD40LIg gene group on day 30 after transplantation; SP,original magnification 200在前期研究中,我们利用羊膜建立诱导体系将小鼠胚胎干细胞定向诱导为表皮样细胞(epidermal-like cells, ELC),形态学上呈现典型的表皮样单层细胞,免疫组化染色显示,分化后的 ELC表达表皮特异标志物1 整合素(1-integrin)?角蛋白 19(cytokeratin,
3、 CK19)和角蛋白15(CK15)1?将已诱导的胚胎干细胞植入裸鼠皮下获得的瘤体进行病理切片,可见大量表皮样和表皮附属器样结构?这表明羊膜诱导体系能够将胚胎干细胞诱导为表皮细胞,诱导后的细胞具有分化为表皮及表皮附属器的潜能2?但从胚胎干细胞分化为 ELC的过程中,基因表达谱系的时空变化?起关键作用的信号通路以及相关的表观遗传学调控机制等尚不清楚?本研究先行从全基因组表达芯片分析入手,筛选出分化前后发生显著差异表达的基因,通过基因本体(gene ontology, GO)分析和通路(pathway)分析方法初步明确这些差异表达基因的大体分类和参与的信号通路,为进一步寻找决定分化方向的关键基因及
4、其调控机制奠定基础?1 材料与方法1.1 材 料ES-BALB/c 小鼠胚胎干细胞(中山大学附属眼科中心黄冰教授惠赠)?滤膜孔径为 3m 的双层 6孔培养板(Transwell),购于 Costar公司?DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium)?小鼠白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor, LIF)胰蛋白酶和胎牛血清均为 Gibco公司产品;TRIZOL 为 Invitrogen Life Technologies公司产品;氯仿为上海化学试剂有限公司产品;异丙醇为上海化学试剂有限公司产品;无水乙醇为上海化学试剂有限公司产品;In
5、vitrogen Superscript 双链 cDNA 合成试剂盒为 Invitrogen产品;单标 DNA试剂盒?杂交系统 4均为 NimbleGen公司产品?1.2 方法1.2.1羊膜制备取足月妊娠剖腹产的胎膜,钝性分离除去绒毛膜,用含庆大霉素的生理盐水反复冲洗,去除血污,剪切成大小约为 3 mm5 mm方形,浸泡于 ESC培养液中备用?1.2.2ESC 体外诱导分化取传代培养 48 h的 ES-BALB/c细胞,以 1.25 g/L胰蛋白酶-EDTA 消化液消化,按 5108 cells/L接种于双层6孔培养板的下层,然后将制备好的羊膜置于双层培养板的上层,用无 LIF ESC培养液培
6、养?每隔 24 h将培养液换掉一半,培养 3 d,倒置镜下观察细胞形态变化?1.2.3RNA 抽提TRIZOL 法提取小鼠的 ESC及诱导后的 ELC的总RNA,将 1 mL TRIZOL试剂直接加入 6孔板中反复吸充分裂解细胞;酚氯仿两相分离,RNA 全部分配在水相,将水相转移异丙醇沉淀 RNA,离心收集,去上清;每 1 mL TRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少 1 mL的 750 mL/L 乙醇,清洗 RNA沉淀,振荡离心;去除乙醇溶液,空气中干燥 RNA沉淀 510 min,加入无 RNA酶的水用枪反复吹打几次,然后 55到 60 孵育 10 min?获得的RNA溶液保存于-70 ;紫
7、外吸收测定法测定 RNA的纯度及浓度;变性琼脂糖凝胶电泳检测 RNA的完整度?1.2.4cDNA 的合成与样本荧光标记双链 cDNA的合成采用Invitrogen Superscript 双链 cDNA 合成试剂盒 (Invitrogen, 11917-020)提供步骤合成 cDNA,以总 RNA平为模板,采用 Oligo dT Primer反转第一链,T4DNA 聚合酶系统合成第二链 cDNA;用 RNase A 消化掉多余的RNA残留;采用 NimbleGen单标 kit,Cy3-Random Nonamers标记,标记产物根据浓度,计算每管 Cy3标记的样本的量,并参照“RNA_cDNA
8、_Labeled DNA -QC”指控情况来进行下一步的杂交实验?1.2.5全基因表达谱芯片杂交所用芯片为上海康成生物提供的Mus musculus 12X135k v2 array小鼠全基因表达谱芯片,芯片含有 13万 5千根 60mer长的探针,共含有小鼠基因数 44170,每个基因的探针重复数 3次,源于数据库 NCBI MM9?ELC和 ESC分别于芯片杂交,每组 3次生物学重复,共 6张芯片?采用 NimbleGen杂交系统 4进行杂交,将标记好的样本充分溶于 VWR水中,再与 NimbleGen的杂交液 kit按比例配好(3.3 L 8.7 L)按操作说明进行一系列反应步骤,整个过
9、程需避光,最后放入杂交盒中 42 16 h 反应,反应完成后洗脱,离心甩干?1.2.6图像采集和数据分析芯片结果由 Axon的 GenePix 4000B单通道扫描仪进行扫描读取,采用 NimbleScan v2.5读取芯片原始信号值并对读取的信号值进行修正及标准化处理,将芯片读取后的数据采用GeneSpring v11.0软件进行诱导的 ELC组与 ESC组进行比较分析其差异变化分析?设定阈值为 2,Fold Change2 为上调,Fold Change2 为下调,并NimbleScan v2.5对基因表达谱进行基因注释,并对全基因进行 GO及Pathway功能分析?1.2.7实时定量 P
10、CR验证挑选信号通路中变化大的差异基因,进行验证?依照 GenBank序列号获取全长 cDNA序列,由上海康成生物设计并合成上下游引物?在 ABIPRSIM7900 检测仪上进行 SYBRGreen 法荧光定量 PCR检测?各样本的目的基因及管家基因分别进行实时定量 PCR反应?根据梯度稀释 DNA绘制标准曲线,各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成?每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度,即为此样品此基因的校正后的相对含量?1.3 统计学处理采用 NimbleScan v2.5对芯片进行扫描,获得原始信号值;GeneSpring v11.0 软件分析对芯片结果原始信号值进行标准
11、化,T 检验比较样本之间的差异表达情况?2 结 果2.1 ESC 分化前后的形态学变化ES 在分化前呈现巢式生长,集落大多呈圆形态或椭圆形态,边界光滑,细胞排列紧密,细胞边界不清(图 1A);诱导 3 d 后,细胞形态出现明显变化,细胞大而扁平,呈多边形,排列紧密,细胞边界清晰,呈典型单层上皮样改变(图 1B)?2.2 样本 RNA质量检测ESC 组和 ELC组各制备 2次重复样本(每组随机选取一份样本做基因芯片的平行重复实验),进行总 RNA的抽提,4 份样本的 D(260/280)值均在 1.82.1范围内, D(260/230)值均大于 1.8,说明 RNA纯度高,可用于后续实验?浓度在
12、 1109 3205 ng/L 之间,每管样本共 30 L 的量,样本量充分足够实验所需?2.3 基因表达谱芯片数据差异分析采用 NimbleGen 12X135K小鼠全基因组表达谱芯片进行杂交,样本采用 Cy3绿色荧光标记(图 2)?从 6张芯片扫描图上可见每张芯片信号均匀,清晰没有边缘化效应?刮伤等影响信号值,阳性定位点和阴性对照区域结果明显?利用小鼠全基因表达谱对 ESC及诱导后的 ELC进行检测发现,在总共 44170个基因转录本中,有 25285个基因转录本有表达,占总转录本的 57.2%;应用软件 GeneSpring v11.0,对结果进行差异分析,在差异表达谱中显示 ESC与诱
13、导后的 ELC差异基因多达 4856个,且在统计学意义范围内 P值0.05,cut off=2;其中上调基因数为 2659个,下调基因数为 2197个?采用常见的层次聚类法(Hierarchical clustering)对 6个芯片的结果进行分析,显示同组样本聚集程度好,小鼠 ES和诱导后的 ELC明显区分开(图 3)?2.4 基因表达谱 GO及 Pathway生物信息学分析通过 GeneSpring v11.0软件对 6张小鼠的全基因表达谱芯片的差异基因进行注释系统(gene ontology)分析和信号通路(pathway)分析,探讨这种共表达现象在生物学上的意义?分析结果显示在 GO三
14、大类中,生物学过程(biological process,BP)?分子功能(molecular fuction,MF)?及细胞组分(cellular component,CC)总共有 3735个基因表达水平发生了变化?按照可信值由高到底排列各挑选前 10位的注释情况见(表 1)?在Pathway分析结果中显示共有 2987个差异表达的基因发生了变化,并挑选可信值高的前十位进行分析见(表 2)?2.5 荧光定量 PCR实验对结果进行验证分析结合全基因表达的 GO分析及 Pathway分析挑选出可信值高,并可能在小鼠 ESC诱导 ELC相关的基因做进一步的芯片验证实验,以证实芯片的结果的可靠性?我
15、们这里挑选了 GO中的生物学过程(BP)的细胞黏附因子(cell adhesion)过程和 pathway中的细胞周期(cell cycle)的 5个基因(CCND2?CDK7?CDH17?PCDH12 和 CNTN1)做验证,验证显示挑选的基因的芯片差异结果和 RT-PCR结果趋势一致的(图 4),各基因在两组样本间的表达水平具有显著差异(P0.05),表明芯片数据真实可靠,可为后续的功能研究提供依据?3 讨 论细胞分化是一个从全能到多能,最后到专能,外延不断缩小,内函不断扩大的过程?在这个过程中,基因组并未发生明显的序列变化,而是通过基因表达有序的时空变化实现的,即基因表达谱的变化?基因表
16、达谱的变化控制蛋白组的变化,进而控制细胞功能和表型,因此,基因表达谱有序的时空变化是个体发育过程中的主旋律,其中隐藏着大量与生命发生有关的玄机?从表达谱比对入手,可望阐明细胞定向分化的关键调控机制,为细胞分化?个体发育研究进行理论和方法学探索?全基因表达谱芯片技术作为基因组学研究的工具,经过多年的发展和检验,已是一种成熟,可靠的常用技术?这种技术可以将某一空间和时间的样本转录组水平的表达情况整体的展现出来?这里我们研究采用的是NimbleGen公司的 12X135k的芯片,基因组设计源于 NCBI MM9权威数据库,每张芯片含有 13万 5千根探针含有 44170个小鼠转录本基因信息,每个转录
17、本基因有三次特异性探针技术重复设计,每个基因的长寡核苷酸探针的长度为 60 mer,可以提供更高的信噪比?灵敏度?专一性和辨别能力?使用该芯片检测出小鼠 ESC及诱导后的 ELC的差异表达谱,得到关于影响小鼠ESC诱导为 ELC的大量宝贵的基础信息,为进一步研究其中的发生机制提供了依据?GO 分析是对差异表达的基因进行生物学功能进行注释,并筛选出在两个实验组之间具有显著差异的 GO条目,GO 条目从生物过程?分子功能?和亚细胞组分三个方面对基因的功能进行分类3?从 GO分析结果中,其中涉及的相关差异基因 3735条,我们选择基因分类错误率(false discovery rate of the
18、 GOID, FDR)最小的前 10位进行一个初步分析,在生物学过程中,主要是以一系列的细胞基础代谢及生物合成为主,提示在小鼠 ESC定向分化为 ELC的过程正如其在胚胎发育的过程中表现的情形类似,开启细胞的相关代谢过程,大量合成成熟分化后细胞所行使生物学功能相关的蛋白组分?在生物学合成的过程中,某些基因的表达开启了引导合成分化后细胞的功能相关蛋白,其中我们会选取具有代表性意义的基因,进行下一步的功能分析,看是否此基因的表达情况能否影响其表型的发生?在分子功能的 GO条目中,我们可以看出小鼠 ESC在诱导分化为ELC的过程中是处于一种高度的合成状态,合成分化后细胞需要的各个部件,同时也在关闭某
19、些基因的表达,这可能与组织的特化相关?在细胞成分GO分类中,我们可以看出细胞膜上的组分合成相关基因的变化差异较大,本身表皮是属于生物体的一种不同于其他细胞器样的膜基质的细胞成分,故细胞膜上的基因表达差异变化明显?这一系列基因表达的变化对于 ESC分化为 ELC均可能是必要的?从细胞黏附相关的基因中我们发现钙黏蛋白基因 CDH17的表达量是下调的,研究表明 CDH17的主要功能是需要钙离子依赖活性?转运各种寡肽在膜上的一个功能团,在许多研究中表明它的过表达会导致癌症的发生,是癌症发生的标志物4?在本研究中定向诱导分化为 ELC的发育研究的结果是符合生长发育的基本规律,但是 表达量下降还是有存在一
20、定的表达量,这很有可能在定向分化的过程中 CDH17还是起到某种重要的作用;PCDH12 也是一种钙依赖性跨膜蛋白,有研究报道它的确实会影响到组织形态的形成,血管生成,细胞-基质的黏附和迁移,免疫反应,和染色质重塑5?在本研究中未分化的 ESC的 CDH17表达量,相比已分化完成的 ELC大很多,这提示,CDH17 可能是 ESC未分化状态的标志之一,或与 ESC干细胞特性和分化潜能的维持相关?CNTN1 参与 DNA甲基化?细胞黏附?Notch 信号通路生物学过程,也是一种膜上蛋白,具有与 DNA结合?蛋白结合?N 端转移酶活性?GPI 锚定的分子功能,我们知道 DNA甲基化在定向分化的过程
21、中起着非常重要的作用,某些基因的甲基化和去甲基化,直接决定分化后的生物表型和功能,在生长发育和疾病发生中有指导作用6-7,这对今后更深入的研究胚胎干细胞分化为 ELC的发生机制给予提示和奠定基础?在信号通路的分析结果中,按通路中的差异基因的富集分值大小,选择富集程度高的前 10个同路的情况进行分析,发现其中在诱导成为 ELC占主要地位的通路是细胞周期和剪接体通路?并且在通路分析中,我们同样看到跟合成和代谢相关的通路也发生了比较大的变化?这里我们着重挑选一些感兴趣基因进行了讨论,细胞周期相关的基因细胞周期蛋白 CCND2参与细胞周期的调控过程,细胞分裂等,定位在核内,具有蛋白结合功能和细胞周期依
22、赖性蛋白激酶调控活性8-9?此基因的表达调控也受到许多研究者的重视,研究其上游调控因子,或者其本身调控的功能,研究发现它是中胚层细胞增殖的关键10,而表皮属于外胚层,提示,中胚层和外胚层在细胞增殖过程中具有相类似的调控机制?CDK7 参与转录过程?DNA 依赖的转录调控?蛋白氨基酸的磷酸化?细胞周期和细胞分裂过程,是核内的一种分子结构,具有核苷酸结合?蛋白激酶活性?蛋白丝氨酸苏氨酸激酶活性?细胞周期依赖的蛋白激酶活性?ATP 结合?转移酶活性等功能,本实验中此基因的表达在定向分化过程中具有明显上调的趋势,提示 CDK7在 ESC定向分化为 ELC后在维持 ELC细胞形态和功能上有一定作用?综合
23、以上分析,从 ESC体处定向分化为 ELC的过程中,基因表达谱发生了巨大的变化,包括众多信号分子?酶和细胞结构蛋白基因表达的变化,提示,细胞分化不是一简单的分子事件,而是由一系列分子事件共同协作完成?该定向分化的关键分子调控机制尚需要进一步大量的实验研究阐明,我们的后续实验将从这些筛选出的结果中,挑选感兴趣的基因,讨探其在分化过程中所起作用及作用机理?【参考文献】张仁礼, 李海标, 黄冰, 等. 人羊膜诱导胚胎干细胞向表皮样干细胞定向分化的研究J. 中山医科大学学报, 2001, 22(5): 325-328.张仁礼, 李海标. ES细胞源的表皮样干细胞分化潜能的初步研究J. 解剖学报, 20
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