1、光动力疗法对人卵巢癌细胞系 Skov3 凋亡的影响【摘要】 目的 通过对经光动力疗法(PDT)处理后卵巢癌细胞系 Skov3发生凋亡情况的研究，探讨光动力学疗法对体外培养的人卵巢癌细胞的影响。 方法 采用不同能量激光对不同浓度光敏剂(5-ALA)处理过的卵巢癌细胞系(Skov3)进行照射,48 h后应用光镜、电镜进行形态学观察,同时利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 结果 倒置显微镜下经光动力学处理后 Skov3细胞体积缩小，细胞变形、皱缩，细胞核浓缩、深染，染色质密集成斑块状，细胞间失去彼此连接，透射电镜下可见致密的染色质沿核膜下聚集，有凋亡小体形成。流式细胞仪定量分析最大细胞凋亡率为 60.
2、5 %。 结论 PDT通过诱导凋亡对体外培养的 Skov3细胞产生杀伤作用。 【关键词】 光动力学;细胞凋亡;卵巢癌【Abstract】 Objective The apoptosis of ovarian cancer cell line Skov3 under the photodynamic therapy were studied to explore the effect of photodynamic therapy in gynecological cancer. Methods Ovarian cancer cell line Skov3 treated with differ
3、ent doses of photosensitizer 5- ALA were radiated by laser with difference doses, then morphological characteristics were studies by light microscopy and electronic microscopy, and cell apoptosis were studied with flow cytometry (FCM). Results The cytomorphosis and shrinkage, nucleus condensation an
4、d anachromasia, and dense chromatin lining along the cell membrane were observed under inverted microscope in cell line received photodynamic therapy. Through transmission electron microseope(TEM), we found that nucleus chromatin gathering along membrane of cell nuclear and apoptotic body formed. Th
5、e maximum inhibition rate was 60.5 %, examined by FCM. Conclusion Photodynamic therapy inhibits the growth of ovarian cancer cell line, Skov3 in vitro.【Key words】 Photodynamic therapy; Apoptosis; Ovarian cancer光动力学疗法(photodynamic therapy,PDT)是除手术、化疗和放疗等传统肿瘤治疗手段外的一种新的肿瘤治疗方法。它是利用光敏剂在人体内选择性聚集的特性，经适合波长的
6、光源照射后产生光化学反应，从而对肿瘤细胞产生杀伤作用1。目前对于 PDT引起细胞损伤的确切机制还不是很清楚，但近几年的研究认为，PDT 主要是通过诱导细胞凋亡来实现杀伤肿瘤细胞的目的24。PDT 的优点是可以对光照波长、强度和部位进行选择，因而其特异性较好，对健康组织损害小，并发症及不良反应很少，有很好的临床应用前景。本实验通过对卵巢癌细胞系 Skov3体外进行光动力学治疗后细胞凋亡的研究，探讨光动力学对肿瘤细胞的杀伤作用。材料与方法一、材料1.卵巢癌细胞:2005 年 612 月，由北京协和医院妇科肿瘤实验室提供经传代的卵巢癌细胞系 Skov3。2.主要试剂:光敏剂 5-氨基乙酰丙酸(5-A
7、LA)、FITC-Annexin/PI凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司;含 10 %热灭活小牛血清的 RPMI1640培养液购自美国 GIBCO公司;姬姆萨(Giemsas)染料购自北京赛百胜生物公司。3.主要仪器:LH-多功能激光治疗仪(天津市雷意光电技术公司生产)由北京协和医院激光室提供;倒置显微镜(日本 Olympus公司)由北京协和医院妇科肿瘤实验室提供;JEOL 1010型透射电镜(日本电子公司)由北京协和医院电镜中心提供;EPICS-profile 流式细胞仪(美国 coulter公司)由北京协和医院流氏细胞仪室提供。二、方法1.细胞培养：取卵巢癌细胞系 Skov3，贴壁
8、生长在含有 10 %胎牛血清的 RPMI-1640培养基中培养。将细胞按 1105/孔接种于 96孔板中，细胞培养在 5 % CO2浓度、饱和湿度及 37 条件下进行，细胞融合 80 %时以 0.25 %胰酶消化传代。含 10 %热灭活小牛血清的 RPMI 1640培养液。2.光动力学疗法。光敏剂 5-ALA分别按 0.1、0.5、1.0、2.5 mmol/L的浓度配制，按每孔 100 l 加入已培养 24 h的细胞中，每一种光敏剂浓度与光照强度设 3个复孔，对照组分别为仅照光而不加光敏剂组和既不加光敏剂也不照光组。细胞加入光敏剂后避光培养 4 h。弃去含光敏剂的培养液，每孔加入 1640培养
9、液 200 l 后在避光条件下以波长630 nm的氦-氖激光照射各孔细胞，照射光能量密度分别设定为0.1、0.5、2.5、12.5 J/cm2，功率为 53 mW。3.细胞形态学变化观察：(1)倒置显微镜下观察细胞形态的变化。照光后细胞经孵育 48 h后，消化，收集细胞， 4 放置，以 500 r/min离心 5 min,弃上清液，磷酸盐缓冲液(PBS)重新悬浮细胞，将细胞悬液均匀涂布于载玻片上，晾干后用甲醇固定 1 min，晾干。在细胞上滴加两滴姬姆萨染色工作液，室温染色 5 min。用蒸馏水轻轻洗去染液，室温晾干24 h用二甲苯浸泡 3 min，去除杂质，使载玻片透明后，以中性树脂封片，在
10、倒置显微镜下观察细胞核形态。(2)电子显微镜下观察细胞形态的变化。光照后细胞经孵育 48 h，吸弃原培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗 1次,policeman 橡皮刮刀刮取细胞收集至 15 ml离心管，加入 PBS,以 800 r/min离心 5 min，吸弃上清液，加入 PBS 1 ml重新悬浮细胞后转移至EP管，800 r/min离心 5 min,吸弃上清液，加入 3 %戊二醛覆盖细胞，置入 4 冰箱固定 12 h后送电镜中心，经四氧化锇再固定，依序丙酮脱水，常规包埋、切片、醋酸铀染色，在透射电子显微镜下观细胞形态、细胞质及细胞核的变化，照相并记录试验结果。4.流式细胞术检测细胞凋亡5，6
11、：根据 MTT比色法分析实验结果，确定光敏剂浓度及光照强度。按上述浓度和强度处理细胞后，胰酶充分消化并收集细胞，以 4 ，1 000 r/min离心 10 min，弃上清液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞 2次，重新悬浮细胞于 200 l 结合缓冲液(binding buffer)中。加入 10 l Annexin -FITC 及 5 l PI(碘化丙啶)染液，混匀后避光室温反应 15 min后加入 300 l 结合缓冲液(binding buffer)，1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果判断,Annexin+/ PI-为凋亡细胞;Annexin+/ PI+为坏死细胞;Annexin-
12、/ PI-为存活细胞。结 果一、细胞的形态学变化贴壁生长的 Skov3细胞经光动力治疗后，相邻细胞间失去彼此连接，轮廓更加清晰可见，细胞收缩变圆，附壁能力减弱，容易从培养板上脱落下来。凋亡后期细胞体积缩小、变形、皱缩，染色质浓缩边集，形成由膜状物包裹内容物的小体，即凋亡小体。对照组细胞生长良好无此现象，透射电镜下见部分细胞表面微绒毛减少或消失，细胞体积缩小，电子密度增大，核仁消失，胞浆内细胞器可见，数量减少，细胞质浓缩，核内染色质密集，并裂解成小块，边集于核膜下。凋亡晚期细胞崩解为碎块，有结构不清的膜状物包裹，细胞器密集压缩，形成凋亡小体。对照组细胞呈现恶性肿瘤细胞特征，无凋亡小体形成。二、流
13、式细胞仪检测细胞凋亡率经一定强度(2.5 J/cm2)激光照射的光动力作用后，流式细胞术双参数散点图显示，实验组细胞按光敏剂浓度的不同(0.1、0.5、1.0、2.5 mM)，其凋亡率分别为 27.1 %、51.1 %、46.6 %、60.5 %,见表 1。最大凋亡率达到 60.5 %。随着光敏剂浓度的增加，细胞的凋亡率呈现增加趋势。而仅照光未加光敏剂组细胞的凋亡率为 21.6 %，既未加光敏剂也未照光组(阴性对照组)凋亡率为 11.7 %。表 1 流式细胞仪检测经光动力处理后卵巢癌细胞系 skov3凋亡比例(%)讨 论PDT 是近年来发展起来的一种肿瘤治疗方法，它通过光化学和光生物学的作用，
14、使肿瘤细胞发生不可逆的光化学破坏。目前已知 PDT介导的细胞死亡有两种，即凋亡和坏死，PDT 药物的主要作用机制可能通过诱导细胞凋亡，从而达到治疗目的7。PDT 的最大优点在于其对肿瘤细胞高度的选择性和组织特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常组织的影响很小。在 PDT的治疗中，机体吸收光敏剂后，经过一定时间后再进行激光照射，这时病变区域的光敏剂浓度仍维持在较高水平，而正常组织中的光敏剂浓度已降至低水平，既可保证对病灶的有效杀伤，又能减少对病灶周边正常组织的损伤，从而获得最佳治疗效果8。以往对细胞凋亡的认识由于研究手段的限制，仅停留在普通形态学水平上，对凋亡细胞的动态和功能变化缺乏了解。本实验结
15、合透射电镜和流式细胞仪，得以更全面地了解凋亡现象。经光动力处理后的细胞改变符合凋亡的特征变化，细胞变圆，继而皱缩，细胞间失去彼此连接。电镜下凋亡细胞染色质浓缩边集，靠近核膜，细胞核体积逐渐缩小，并固缩成为致密体，最终与各种细胞器成分形成具有完整模性结构的凋亡小体。结果显示光动力疗法可以通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现杀伤肿瘤细胞的作用。流式细胞术进一步验证了 PDT诱导细胞凋亡与药物浓度的关系，经一定强度(2.5 J/cm2)激光的光动力作用后，本研究用 FITC标记的Annexin和 PI对细胞进行双染色，结果显示，在光动力作用下，实验组细胞的凋亡率均高于对照组，并且随着光敏剂浓度的增加，细胞的凋
16、亡率也随之增加，最大凋亡率达到 60.5 %。细胞的凋亡表现出良好的药物浓度依赖性，并且没有出现明显的细胞坏死。由此表明，细胞的死亡模式可能主要取决于所选细胞类型、PDT 剂量和光敏剂种类9，对于某种固定的光敏剂来说，细胞死亡的方式从凋亡到坏死是与 PDT剂量相关的10。因此提示，在临床治疗中要根据治疗需要和肿瘤的种类选择适当浓度的光敏剂，使治疗效果达到最大化的同时，不良反应最小。PDT 可经内窥镜进行介入治疗的微创性、适用于各个阶段肿瘤的广谱性以及可与手术和放化疗同时进行治疗的协同性等，其总有效率可达 85 %11，为肿瘤的综合治疗提供了一种新思路、新方法，将会有更广泛的应用前景。【参考文献
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