1、ELISA检测“乙肝二对半” (Enzyme linked immunosorbent Assay ELISA),酶免疫技术分类,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,均相酶免疫测定,非均相酶免疫测定,ELISA的概念,酶联免疫吸附试验 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）酶联：抗原或抗体的酶标记。免疫：以抗原抗体特异性反应为基础。吸附：抗原或抗体包被于固相载体表面。 在固相载体表面实现抗原抗体的反应，通过酶标记的手段，酶催化底物形成水解、氧化或还原反应，形成有色物质，其颜色的深浅与标本中的抗原或抗体的量直接相关。,ELISA技术特点,具有良好的灵敏度和
2、特异性，能满足临床需要，应用广泛。操作简单、无需昂贵的仪器投入，价格便宜。对环境几乎没有污染。,ELISA技术的应用,检测抗原的方法：双抗体夹心法竞争法,检测抗体的方法：双抗原夹心法间接法竞争法捕获法,实验目的,掌握ELISA法检测“乙肝二对半” 的原理、操作步骤及注意事项。掌握检测“乙肝二对半”的临床意义。,什么是“乙肝二对半”？,“乙肝两对半”是指：表面抗原（HBsAg）、表面抗体（HBsAb）、e抗原（ HBeAg ）、e抗体（HBeAb）、核心抗体（HBcAb）HBsAg本身不具有传染性，只具有抗原性保护性抗体： HBsAb传染性指标： HBeAg ， HBcAgHBeAb， HBcA
3、b不是保护性抗体，而是反映曾被HBV感染的重要指标。,为什么不检测核心抗原（HBcAg）,HBcAg主要位于病毒颗粒中，只有少数游离。机体免疫系统对HBcAg很敏感，易产生高滴度的HBcAb,与HBcAg 形成免疫复合物。血清中， HBcAg可丢失部分氨基酸。,“乙肝二对半”的检测原理,HBsAg：双抗体夹心法HBsAb：双抗原夹心法HBeAg：双抗体夹心法HBeAb：中和竞争法（血清中的e抗体与固相e抗体竞争结合e抗原）HBcAb：竞争抑制法,双抗原（体）夹心法测抗体（原）,Anti-HIV, Anti-HBs,双抗体夹心法,双抗原夹心法,HBsAg ,HCV core Ag, HBeAg,
4、HBV preS1,PreS2,双抗体夹心法测抗原,+,-,Y,Y,E,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,竞争抑制法测抗体,包被抗原,Anti-HBcAnti-HBe,中和竞争法测抗体,Anti-HBe,试剂盒组成,包被反应板：固相的抗原或抗体酶结合物：酶标记的抗原或抗体显色剂：分A、B二瓶终止液对照：阳性对照，阴性对照浓缩洗涤液 中和试剂（只有检测HBeAb的试剂盒才有）,实验准备,配制洗涤液：用蒸馏水按1：20稀释浓缩洗涤液。为节省试验时间，除检测核心抗体（HBcAb）组外，其余组可在加样后的温育时间中才配制洗涤液。,实验操作,1、加样：第一、二孔为阴、阳对照
5、孔，分别加入阴、阳对照50ul。其余各孔为样品孔，各加入待测标本50ul（检测HBcAb 时，待测标本需用稀释后的洗涤液做1：30稀释）。2、加中和试剂（只有检测HBeAb时才需要）：每孔50ul3、加酶结合物：每孔50ul4、温育：封板充分混匀后置37C水浴30分钟5、洗涤：弃去反应条孔内液体，用洗涤液注満每孔，放置或振荡1分钟，弃去拍干反复5次（注意：最后一次一定要拍干）6、显色：每孔先加显色剂A 50ul，再加显色剂B 50ul，混匀后置37C水浴10分钟7、中止显色：每孔加入中止液50ul8、判断结果：,目测法：,HBsAg， HBsAb， HBeAg,HBeAb ， HBcAb,比色
6、法：波长450nm读取各孔OD值HBsAg， HBsAb， HBeAg 样品OD值/阴性对照OD值2.1 HBeAb ， HBcAb阴性对照OD值/样品OD值2.1（建议双波长比色（450/630nm）；临界值的确定请参考实验指导，不同的试剂盒和检测原理，临界值的设定均不同）,阳性,阳性,ELISA的注意事项,标本：内源性（RF、补体、嗜异性抗体等） 外源性因素（溶血、细菌污染、保存不当、凝集不全、防腐剂NaN3等）（P229）试剂：试剂质量、批号、是否失效（冰箱温度）、平衡（37度C30分钟）、摇匀加样：加样准确、不可太快，避免加在上部和产生气泡。温育：温度（定期观察与登记）、时间、湿度、封片（不可重复用）洗板：洗涤液用蒸馏水或去离子水现配、防止洗板机堵塞、洗完要拍板。显色：加试剂时不可重复加和漏加，或加在两孔之间，不要产生气泡，及时终止。比色：建议用双波长（可排除标本浓度、干扰色、电路干扰、板底部划痕的影响）。结果判定：反应终止后10分钟内质量控制：内对照、室内质控、室间质评等（全程质控意识）表面抗原阳性结果、灰区标本、矛盾结果或少见模式均须复查生物安全：试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处理。,常见的检测模式（临床意义2）,思考题,sAg检测时，有哪些因素可能导致阴性对照孔也出现颜色？为什么建议用双波长比色。,
