1、鬼臼毒素固体脂质纳米粒经皮渗透和皮肤贮留研究【摘要】 目的 研究鬼臼毒素固体脂质纳米粒经皮渗透和皮肤贮留情况。方法 采用 Franz 扩散池测定鬼臼毒素固体脂质纳米粒的经皮渗透速率，扩散池与供给池之间为大鼠或家兔腹部皮肤，扩散池面积为 2.92 cm2。在体外透皮试验完结后，取下皮肤，剪碎匀浆，用 50%异丙醇 生理盐水提取，提取液处理后用 HPLC 测定药物浓度。结果 制得的鬼臼毒素固体脂质纳米粒包封率平均为 95.28%，RSD 为 2.53% (n=5)，粒径在50200 nm 之间。固体脂质纳米粒作为载体时，鬼臼毒素经大鼠和家兔离体腹部皮肤的平均渗透速率和累积透过量较市售酊剂明显降低，
2、同时药物贮留量较市售酊剂明显提高。结论 鬼臼毒素固体脂质纳米粒具有较强的皮肤靶向性。 【关键词】 鬼臼毒素;固体脂质纳米粒;经皮渗透;皮肤贮留Abstract:Objective To study in vitro transdermal penetration and retention of podophyllotoxin solid lipid nanoparticles(SLN). Methods The in vitro transdermal penetration of podophyllotoxin from SLN was determined by Franz diffus
3、ion cells. Between donor compartment and receptor compartment was abdominal skin of rats or rabbits,the avaiable diffusion area of cells was 2.92 cm2. The sample was analyzed by HPLC after treatment. After in vitro transdermal penetration experiment completed,the skin were taken down from cells,cut
4、and homogenated,then extracted with 50% isopropanolnormal saline. The extracting solution was analyzed by HPLC. Results The encapsulation efficiency of obtained podophyllotoxin solid lipid nanoparticles were 95.28% on average,with RSD was 2.53% (n=5) and diameter between 50200 nm. When solid lipid n
5、anoparticles as deliverer,the average transdermal rate and cumulative transdermal quantity of podophyllotoxin through rat and rabbit abdominal skin in vitro were significantly lower than marketed tincture,while skin retention quantity of podophyllotoxin in rat and rabbit abdominal skin were signific
6、antly higher than marketed tincture. Conclusion Podophyllotoxin SLN had higher local concentration of drug in skin.Key words:podophyllotoxin; solid lipid nanoparticles; skin penetration; skin retention鬼臼毒素(podophyllotoxin,POD)亦名足叶草毒素，为小蘖科桃儿七根茎部提取的有效成分，体外药效试验证明能抑制培养的正常人皮肤角质形成细胞和宫颈癌上皮细胞的脱氧核苷掺入和 DNA 合成
7、，阻碍其分裂和增殖1。以鬼臼毒素为主药的制剂在临床已应用多年，其治疗作用已得到肯定。目前临床上广泛使用 0.5%鬼臼毒素酊剂治疗尖锐湿疣，多发性浅表性上皮瘤病(如多发性浅表性或浸润性基底细胞上皮瘤，鳞状细胞上皮瘤和基底鳞状细胞上皮瘤)，前上皮瘤性角化病，脂溢性角化、日光性角化和射线角化病，幼年喉头乳头瘤、疣(寻常疣、丝状疣)等疾病2-4。但鬼臼毒素酊剂大面积使用时易产生吸收毒性，因此限制了其使用范围。固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticle，SLN)是以固态的天然或合成的脂类如硬脂酸、磷脂、三酰甘油、长饱和脂肪酸等作为药物载体，将药物包裹或夹嵌于类脂核中制成粒径约为 5
8、01 000 nm 的粒子，具有体积小、脂溶性大、皮肤靶向性较强5-6等优点。以固体脂质纳米粒作为鬼臼毒素载体的研究在国内开展得较多，但在制备过程中均使用了二氯甲烷等有机溶剂，而且对皮肤贮留情况的研究较少7-10。本研究采用微乳法制备鬼臼毒素固体脂质纳米粒，避免了有机溶剂的使用，并对其经皮吸收和皮肤贮留情况进行较系统的研究。1 仪器与试药LC20A 型高效液相色谱仪(日本岛津公司);C18 反相硅胶色谱柱( 4.6 mm250 mm,5 m, 迪玛科技); TK12B 型透皮扩散试验仪(上海锴凯科技贸易有限公司); FA2004B 型电子天平(上海精密科学仪器有限公司);0MODEL5000
9、型微量移液器(NICHIRYO,日本);HD931 型紫外在线检测仪(上海金达生化仪器有限公司);JEM100CX 型电子显微镜(日本电子株式会社)。鬼臼毒素(福建华海药业有限公司，质量分数 99.5%，批号 080901);鬼臼毒素对照品(中国药品生物制品检定所，质量分数 99.9%，批号111645200501);0.5% 鬼臼毒素酊剂(福建华海药业有限公司，批号081202);0.5%鬼臼毒素固体脂质纳米粒(自制);单硬脂酸甘油酯(国药集团化学试剂有限公司，批号 F20060412);吐温80( 广州化学试剂厂，批号 200707011); 聚乙二醇 400(国药集团化学试剂有限公司，批
10、号F20071210);2,6 二叔丁基对甲酚(国药集团化学试剂有限公司，批号F20071101);Sephadex G50 葡聚糖(ICN Biomedicals Inc.，批号94445);甲醇为色谱纯;其余试剂除均为分析纯。大鼠(SD，200250 g，证号 2008A001)、家兔(雄性，2.2 kg，证号 2008A020)均购自广东省医学实验动物中心。2 方法与结果2.1 固体脂质纳米粒的制备及包封率测定根据文献11改进制备处方和工艺：取单硬脂酸甘油酯 3.0 g、吐温80 4.0 g、聚乙二醇 400 5.0 g、2,6 二叔丁基对甲酚(butylated hydroxytolu
11、ene,BHT) 0.04 g，置 70 水浴使其完全熔融形成溶液;然后在 200 rmin-1 搅拌、70 下加入鬼臼毒素 0.5 g，继续搅拌直至形成澄清透明溶液;然后加入 10 mL、70 的水，于 200 rmin-1 搅拌 20 min，形成稳定均一的纳米乳;将纳米乳迅速倒入以 1 000 rmin-1 搅拌的 80 mL、2 的水中，搅拌 5 min 后转速调至 200 rmin-1，搅拌 3 h，即得。同法制备不含鬼臼毒素空白固体脂质纳米粒。鬼臼毒素固体脂质纳米粒的混悬液略带银白色乳光，其微观形态见图 1。从图 1 可见，鬼臼毒素固体脂质纳米粒为圆形实心小颗粒，粒径在 50200
12、 nm 之间。采用凝胶柱层析法测定上述制品的包封率，常法装 Sephadex G50 凝胶柱(1.5 cm30 cm)，取空白脂质纳米粒 1 mL 上柱，以水洗脱，饱和柱子;再分别精密吸取载药脂质纳米粒混悬液 0.2、0.3、0.5、1 mL上柱，以水洗脱，流速 1.0 mLmin-1，在线检测紫外吸收。结果表明，载药脂质纳米粒混悬液上样量为 0.2 mL 时，凝胶柱可将含药脂质体和游离药物完全分离，柱加样回收率平均为 99.32%，RSD 为 1.64%(n=5)。精密移取鬼臼毒素固体脂质纳米粒混悬液 0.2 mL 上柱，以水洗脱，分段收集后，测定游离药物的量，按 (m 总-m 游离)/m
13、总100%(m 总：总药物量，m 游离：未包入纳米粒的游离药物量)计算包封率，结果制品包封率平均为 95.28%，RSD 为 2.53%(n=5)。2.2 分析方法的建立2.2.1 色谱条件 色谱柱为 Diamonsil C18 柱(4.6 mm250 mm，5m)，流动相为甲醇 水 冰醋酸(体积比 59410.6)9， 检测波长为 292 nm， 流速为1 mLmin-1，柱温为 30 ，进样量为 20 L。精密称取 10.0 mg 鬼臼毒素对照品，置 50 mL 量瓶中，用甲醇定容，0.45 m 滤膜过滤，取续滤液进样分析，记录色谱图如图 2。各取空白固体脂质纳米粒混悬液和载药固体脂质纳米
14、粒混悬液 0.1 g，置 25 mL 量瓶中，用甲醇定容，0.45 m 滤膜过滤，取续滤液进样分析，记录色谱图如图 3。由图可见，辅料在该色谱条件下对主药的测定没有干扰。将动物皮肤夹在透皮扩散试验仪供给池与接受池之间(扩散池面积2.92 cm2)，在供给池一侧加入 1 mL 接受液，接受池含有 7 mL 接受液与搅拌子(搅拌转速 500 rmin-1)，32 恒温搅拌，于 24 h 取接受液0.5 mL， 0.45m 微孔滤膜过滤后取续滤液，按上述 HPLC 条件测定，记录色谱图如图 4。从图 4 可见，空白皮肤在该色谱条件下对鬼臼毒素的测定没有干扰。2.2.2 标准曲线 分别配制质量浓度为1
15、.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 gmL-1 的鬼臼毒素的系列对照品溶液，0.45 m 微孔滤膜过滤，取续滤液注入 HPLC 仪，以峰面积(A)对质量浓度()进行线性回归，得鬼臼毒素线性回归方程：A=9914.7-5690.1， R2=0.999 8。2.2.3 精密度及回收率试验 鬼臼毒素低、中、高(5.0、20.0、40.0 gmL-1)3 种浓度的样品的日内及日间 RSD 分别为1.05%、0.71%、0.63%(n=5)及 1.44%、0.91%、0.95%(n=5);回收率分别为100.16%、99.86%、100.03%，RSD 分别为 0.96%、0.65%、0.76%(n=5)。
