1、橄榄苦苷对核桃油抗氧化稳定性的研究田雨 包媛媛 林奇 杨明 高聪聪 杜鹏（云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201）摘要：通过测定过氧化值（POV） 、清除 DPPH 自由基、清除羟自由基能力以及总抗氧化能力的体外抗氧化活性，探究橄榄苦苷对核桃油的抗氧化能力，并通过响应面法优化，筛选出最佳浓度复配抗氧化剂。结果表明：橄榄苦苷对核桃油有较强的抗氧化和清除自由基的能力，当橄榄苦苷的添加量为 200 mg/kg 时，其POV 值为（12.60.49)mmol/kg,清除 DPPH 能力、羟自由基能力为（72.50.38 ）%、 （760.62 ）%，总抗氧化能力为（69.60.55）
2、%；橄榄苦苷、柠檬酸和 VC对核桃油的抗氧化稳定性有较好的增效作用，最佳浓度配方为 265 mg/kg 橄榄苦苷+135 mg/kg 柠檬酸+197 mg/kg%V C 。关键词：橄榄苦苷；提取；纯化；核桃油；抗氧化1Study on Antioxidative Stability of Walnut Oil with OleuropeinTian Yu,Bao Yuan-yuan,Lin Qi,Yang Ming,Gao Cong-cong,Du Peng(College of Food Science and Technology,Yunnan Kunming 650201,China)A
3、bstract: The antioxidant capacity of oleuropein to walnut oil was investigated by measuring the peroxide value (POV), scavenging DPPH free radicals, scavenging hydroxyl radical capacity, and total antioxidant capacity in vitro.The best concentration of compound antioxidants was selected by response
4、surface methodology.The results showed that oleuropein had strong antioxidation and scavenging activity against walnut oil.When the oleurope addition was 200mg/kg, its POV value is12.60.49mmol/kg,the ability of scavenging DPPH and hydroxyl radical was 72.5 + 0.38%, 76 + 0.62%, and the total antioxid
5、ant capacity was 69.6 + 0.55%.Oleuropein, citric acid and VC had a good synergistic effect on the antioxidant stability of walnut oil. The best concentration formula was 265 mg/kg oleuropein + 135 mg/kg citric acid + 197 mg/kg% VC.1基金项目：云南省高校食品加工与安全控制重点实验室（3008365） ；云南农业大学重点培育学科园艺产品加工（特色研究） （2001209
6、）收稿日期：2018-05-17作者简介：田雨，女，1993 年出生，硕士，食品工程。通信作者：包媛媛，女，讲师，博士，主要从事农用化学物质与环境的研究。Key words:Oleuropein;Extraction; Purification;Walnut oil;Antioxidant核桃油中不饱和脂肪酸含量较高，在人体健康的血压调节、糖尿病预防等方面都有良好保健作用 1-3，然而在加工、储藏、销售时易存在油脂变质情况，不仅破坏了其内部的营养成分，还危害了身体健康，因此将添加抗氧化剂加入油脂以延缓氧化，延长货架期是一种最为有效的手段。目前我国常用的抗氧化剂丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟
7、基甲苯(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)等都是化学合成的，存在一定的毒性和副作用，已被一些国家限制或禁止使用 4-5。于是对天然抗氧化剂的应用研究以取代化学合成抗氧化剂已成趋势。橄榄苦苷是一种裂环烯醚萜类多酚化合物，有抗菌 6-7、抗氧化 8-9、降血压 10-11、抗肿瘤抗病毒 12-14等功效，且主要存在于橄榄叶中。人们长期以来更关注研究橄榄果和橄榄油的食品实用性，而其叶却因大量修剪而废弃，未得到合理利用而造成资源浪费。目前，已有较多有关橄榄苦苷的抗氧化活性研究报道，但未有将橄榄苦苷用于核桃油抗氧化的研究报道。因此，本文对橄榄苦苷进行了优化提取工艺，并研究了橄榄苦苷对核桃油的抗氧化效果
8、，以期能为核桃油的抗氧化提供理论依据，并为木本油料作物的油脂产业升级奠定基础。1. 材料与方法1.1 材料与试剂核桃油：由采购于云南漾濞的核桃压榨而得；橄榄叶：于云南省林业科学院采集而得。试剂：冰乙酸、三氯甲烷、碘化钾、硫代硫酸钠、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、可溶性淀粉、异丙醇、乙醚、氢氧化钠、酚酞均为国产分析纯试剂；DPPH，Sigma 公司；TBHQ、V C、柠檬酸均为国产食品添加剂；橄榄苦苷，实验室自制；乙晴（色谱纯） ，默克公司。1.2 仪器与设备RG-306 榨油机；CP-413 分析天平；FW-200 高速粉碎机；RE-52AA 旋转蒸发器；1200高效液相色谱仪；DHG-9240A
9、电热鼓风干燥箱；SK2200B 超声波清洗器；722 可见分光光度计。1.3 试验方法1.3.1 核桃油的提取直接由榨油机压榨核桃仁，再抽滤除杂而得。1.3.2 核桃油抗氧化稳定性的研究1.3.2.1核桃油预处理依次精密称取 0.015 、0.03 、0.045 、0.06 、0.075 g 橄榄苦苷样品，分别加入到装有 150 g 核桃油的 250 mL 碘量瓶中，超声 2min，使橄榄苦苷与核桃油充分溶解，配成浓度分别为 100、200、300、400、500 mg/kg 的核桃油样。分别依次精密称取 0.03g 的TBHQ、VC 和柠檬酸加入到装有 150g 核桃油的 250 mL 碘量
10、瓶中，超声 2 min，使抗氧化剂与核桃油充分溶解，配成浓度都为 200 mg/kg 的核桃油样作为对照，同时以不添加橄榄苦苷纯样的核桃油作为空白。将所有核桃油样置于 601 的恒温干燥箱中，每隔 2 天测定核桃油的 POV、AV、DPPH、羟自由基和总抗氧化能力，观察核桃油在 10 天内的氧化变质情况。1.3.2.2 核桃油过氧化值的测定 15根据国家标准 GB 5009.227-2016 中的滴定法测定。1.3.2.3 清除 DPPH自由基能力的测定参看文献 16，以乙酸乙酯溶液作为调零参。计算公式如下，式中 Ai为样品与 DPPH 反应液于 517 nm 的吸光度，A i0为样品与乙酸乙
11、酯溶液于 517 nm 的吸光度，A 0为 DPPH 反应液与乙酸乙酯溶液于 517 nm 的吸光度。DPPH 清除率（%）=1.3.2.4 清除羟自由基能力的测定 17各溶液以及核桃油样的加入量按表 1 所示，使反应溶液总体积为 15mL。先在 25mL 试管中依次加入 6mmol/L 的 FeSo4，6mmol/L 的水杨酸乙醇溶液，再加入适量蒸馏水，最后加 0.1%的 H2O2溶液，摇匀后置于 37水浴锅中反应 30 分钟，反应结束后在 3500r/min 速度下离心 10min，最后吸取上清液于 510nm 波长测定吸光度。计算公式如下：OH 清除率（%）= 表 1.羟自由基试验的各溶
12、液加入量试剂/mL组成/ml6mmol/LFeSo4溶液6 mmol/L 水杨酸乙醇溶液样品 蒸馏水0.1 %的 H2O2溶液Ai 1 1 2 10 1Ai0 1 1 2 11 0%1*)(000Aii10*)(00AiiA0 1 1 0 12 1调零参比 1 1 0 13 01.3.2.5 总抗氧化能力的测定参考文献 18，在 10mL 试管中分别加入不同浓度的橄榄苦苷核桃油样品 200 mg/kg 的TBHQ、VC、柠檬酸核桃油样，以及不添加橄榄苦苷的核桃油样，再加入 3 mL FRAP 工作液混匀后置于 37水浴锅中反应 10min，反应结束后于 593 nm 波长测定吸光度。1.3.3
13、 响应面试验设计由于核桃油中的金属矿物质元素较丰富，而 VC、柠檬酸等有机酸主要是通过与金属离子络合，从而形成螯合物，以减弱金属离子对核桃油过氧化反应的催化，复配后使得核桃油抗氧化的效果得到增加。根据 GB2760-2014食品添加剂使用标准 ，将 VC、柠檬酸的添加量设在 200mg/kg 最大限制使用量范围内，再综合橄榄苦苷单因素试验结果，选取橄榄苦苷的用量水平。利用响应面法建立模型，以 POV 值为响应值，采用 BOX-Behnken 设计响应试验方案。将核桃油样于 601的恒温干燥箱中加速氧化，测定核桃油样第 10 天的 POV值。下表为试验因素与水平。表 2 响应面试验因素与水平水平
14、因素-1 0 1A 橄榄苦苷（mg/kg） 100 200 300B 柠檬酸（mg/kg ） 100 150 200CVC（mg/kg ） 100 150 2001.3.4 数据处理与分析每个核桃油样都测 3 次平行，得到的数据以平均值标准差表示，利用 Excel2003 处理数据，利用 Design-Expert 建立响应面模型，利用 SPSS19.0 进行显著性分析。2. 结果与分析2.1. 橄榄苦苷对核桃油的抗氧化稳定性研究2.1.1. 不同添加量的橄榄苦苷对核桃油抗氧化能力比较由图 1 可以看出，在恒温干燥箱中放置 10 天后，未添加橄榄苦苷抗氧化剂的核桃油POV 值高达(69.50.
15、65)mmol/kg ，而添加了橄榄苦苷抗氧化剂核桃油的 POV 值明显都比其小很多，说明橄榄苦苷有良好的抗氧化性，抗氧化效果极显著（ P 0.01） 。当橄榄苦苷浓度为 200mg/kg 时的抗氧化效果最好，且在橄榄苦苷浓度较低时，对核桃油的抗氧化效果随着浓度的增加而增强，而后核桃油的抗氧化效果随着浓度的增加而变弱。0 2 4 6 8 10-20020406080100 100mg/kg 200mg/kg300mg/kg 400mg/kg500mg/kg 对 照时 间/d过氧化值/mmol/kg图 1不同浓度的橄榄苦苷核桃油样 POV-时间曲线2.1.2. 橄榄苦苷与其他抗氧化剂对核桃油抗氧
16、化能力比较油脂氧化反应的发生有三个阶段：第一是引发阶段、接着是传递阶段、最后终止阶段19。第一阶段的氧化反应较缓慢，表现在 POV 值增幅较小，第二阶段的氧化反应速度加快，表现在 POV 值增幅较大，最后阶段油脂基本已经腐败变质，这时的生成的自由基已经相互结合生成新的稳定化合物。由图 2 可知,空白对照和 VC 核桃油样经过 4 天的引发期后，进入第二阶段，特别是从第 6 天开始快速增长，到 8 天开始进入第三阶段终止期；柠檬酸核桃油样同样是经过 4 天的引发期后，进入第二阶段，但是从第 6 天开始到第 10 天一直是快速增长期，还没有进入终止期；跟前面三者相比，橄榄苦苷以及 TBHQ 核桃油
17、样的 POV 曲线变化就很小，一直比较平缓，直到第 10 天还没进入第二阶段传递期。各核桃油样品前期的 POV 值的增幅较小，变化较平稳，且在前 4 天 POV 值升高不显著（ P 0.05） 。随着时间的增加，从第 6 天开始，VC 和柠檬酸核桃油样的 POV 值开始大幅增加，而橄榄苦苷和 TBHQ 的核桃油样在恒温干燥箱中放置 10 天里，POV 值一直是缓慢的增长。将这几种抗氧化剂比较发现：TBHQ、橄榄苦苷 VC 和有极显著的抗氧化效果（ P 0.01） ，柠檬酸有显著的抗氧化效果（ P 0.05） ，即抗氧化能力大小为：TBHQ橄榄苦苷VC柠檬酸。0 1 2 3 4 5 6 7 8
18、9 10-20020406080100 柠 檬 酸 200mg/kgVC 200mg/kgTBHQ 200mg/kg橄 榄 苦 苷 200mg/kg对 照时间/d过氧化值/mmol/kg图 2 不同抗氧化剂对核桃油样抗氧化效果2.2. 橄榄苦苷对核桃油 DPPH 清除能力研究2.2.1. 不同添加量的橄榄苦苷对核桃油 DPPH 清除能力比较DPPH 是一种稳定自由基，可以清除样品中的其他自由基，因此可以通过 DPPH 的清除能力来说明抗氧化能力的强弱，样品溶液中紫色消失越多，清除率越大，抗氧化能力越强，最后变为黄色或无色 20。观察图 3 发现，随着时间的增加，不同浓度橄榄苦苷核桃油样的 DP
19、PH 清除能力也随之下降，即核桃油样氧化的时间越久，其 DPPH 清除能力就越小。在恒温干燥箱中放置 10天后，浓度为 200mg/kg 的橄榄苦苷核桃油样的 DPPH 清除能力明显优于其他浓度核桃油样，为(72.50.38)%，说明 200mg/kg 橄榄苦苷核桃油 DPPH 清除能力最强，有极显著的清除DPPH 能力（ P 0.01） 。当橄榄苦苷浓度较低时，核桃油对 DPPH 的清除能力随着浓度的增加而增强，当橄榄苦苷浓度大于 300mg/kg 时，核桃油的 DPPH 清除能力随着浓度的增加而变弱，清除 DPPH 能力变得不显著（ P 0.05） 。0 2 4 6 8 100204060
20、80100100mg/kg 200mg/kg 300mg/kg 400mg/kg500mg/kg 对 照时间/dDPPH清除率/%Comment m1: 纵坐标中的（） ，改为/ 其他亦同图 3不同浓度的橄榄苦苷核桃油样 DPPH-时间曲线2.2.2.橄榄苦苷与其他抗氧化剂对核桃油 DPPH清除能力比较由图 4可知，在恒温干燥箱放置 10天后，将同为 200mg/kg的抗氧化剂核桃油与空白对照相比：DPPH 清除能力下降幅度最多的是柠檬酸核桃油样，最后仅为(39.60.56)%，VC 的 DPPH清除能力一直保持平稳的下降速度，最后降至(54.50.62)%，而橄榄苦苷与TBHQ核桃油样的 D
21、PPH清除能力下降的都比较少且速度较缓慢，橄榄苦苷为72.50.38%，TBHQ 为(87.90.45)%,橄榄苦苷与 VC的核桃油样 DPPH清除能力差距变得越来越大，说明橄榄苦苷核桃油虽比 TBHQ核桃油样对 DPPH自由基的清除能力弱，但对DPPH自由基的清除能力极显著高于对照柠檬酸、VC 和对照（ P 0.01） 。0 2 4 6 8 10020406080100柠 檬 酸 VC TBHQ 200mg/kg 对 照时 间/dDPPH清除率/%图 4不同抗氧化剂的核桃油样对 DPPH清除能力2.3. 橄榄苦苷对核桃油羟自由基清除能力研究2.3.1.不同添加量的橄榄苦苷对核桃油羟自由基清除
22、能力比较观察图 5可知，随着时间的增加，不同浓度橄榄苦苷核桃油样的OH 清除能力也在随之下降，即核桃油样氧化的时间越久，其OH 清除能力就越小。在恒温干燥箱中放置 10天后，浓度为 200mg/kg的橄榄苦苷核桃油样的OH 清除能力明显优于其他浓度核桃油样，为(760.62)%，说明 200mg/kg橄榄苦苷核桃油OH 清除能力最强，有极显著的清除 DPPH能力（ P 0.01） ；还能发现，300mg/kg 的橄榄苦苷核桃油OH 的清除能力为(65.70.48)%，有极显著的清除 DPPH能力（ P 0.01） ，400mg/kg 的橄榄苦苷核桃油OH 的清除能力为(53.90.73)%，5
23、00mg/kg 的橄榄苦苷核桃油OH 的清除能力却为(50.60.57)%，清除OH 的能力变得不再显著（ P 0.05） ，经 Duncan和 LSD多重比较，发现组间显著性差异明显（ P 0.01） 。0 2 4 6 8 10020406080100100mg/kg 200mg/kg 300mg/kg 400mg/kg500mg/kg 对 照时间/d羟自由基清除率/%图 5不同浓度的橄榄苦苷核桃油样OH-时间曲线2.3.2. 橄榄苦苷与其他抗氧化剂对核桃油羟自由基清除能力比较由图 6 可知，这几个抗氧化剂都有清除OH 的能力。一开始 TBHQ 核桃油样的 DPPH 清除能力最强，橄榄苦苷与
24、 VC 的核桃油样 DPPH 清除能力相差不多，柠檬酸 DPPH 清除能力最弱，随着时间的增加，这几种抗氧化剂的核桃油样对 DPPH 清除能力都在随之下降，但与空白对照相比 DPPH 清除能力下降幅度最多的是柠檬酸核桃油样，最后仅为(39.60.6)%，VC的 DPPH 清除能力一直保持平稳的下降速度，最后降至(51.80.7)%，而橄榄苦苷与 TBHQ核桃油样的 DPPH 清除能力下降的都比较少且速度较缓慢，橄榄苦苷为(75.90.62)%，TBHQ 为(86.90.68)%，橄榄苦苷与 VC 的核桃油样 DPPH 清除能力差距变得越来越大。0 2 4 6 8 100204060801001
25、20柠 檬 酸 VC TBHQ 200mg/kg 对 照时 间/d羟自由基清除率/%图 6不同抗氧化剂的核桃油样对OH 清除能力2.4. 橄榄苦苷对核桃油总抗氧化能力研究2.4.1. 不同添加量的橄榄苦苷对核桃油总抗氧化能力比较FRAP 法常用来测定总抗氧化能力，在酸性条件下，样品溶液会从浅绿色变成蓝色，样品溶液中蓝色越深，清除率越大，抗氧化能力越强。观察图 7 可知，100mg/kg 的橄榄苦苷核桃油总抗氧化能力为(54.790.36)%,有极显著的总抗氧化能力（ P 0.01） ，300mg/kg 的橄榄苦苷核桃油总抗氧化能力为(60.740.47)%，有极显著的总抗氧化能力（ P 0.0
26、1） ，400mg/kg 的橄榄苦苷核桃油总抗氧化能力为(50.570.58)%，500mg/kg 的橄榄苦苷核桃油总抗氧化能力为(42.220.72)%，当橄榄苦苷浓度为 200mg/kg 时核桃油样的总抗氧化能力明显优于其他浓度核桃油样，总抗氧化能力为(69.60.55)%，说明 200mg/kg 橄榄苦苷核桃油总抗氧化能力最强，总抗氧化能效果极显著（ P 0.01） ，经 Duncan 和 LSD 多重比较，发现组间显著性差异明显（ P 0.01） 。0 2 4 6 8 10020406080100100mg/kg 200mg/kg 300mg/kg 400mg/kg500mg/kg 对
27、 照时间/d抗氧化能力/%图 7不同浓度的橄榄苦苷核桃油样总抗氧化能力-时间曲线2.4.2. 橄榄苦苷与其他抗氧化剂对核桃油羟自由基清除能力比较由图 8 可知，这几个抗氧化剂的总抗氧化能力都在随着时间增加而变弱，其中 TBHQ 的总抗氧化能力随着时间的增加降低的幅度最小，将浓度同为 200mg/kg 的不同抗氧化剂核桃油的总抗氧化能力作比较发现：总抗氧化能力测定的最大是 TBHQ,仅为(85.90.36)%，橄榄苦苷次之，总抗氧化能力为(69.60.55)%，V C的总抗氧化能力下降稍快，总抗氧化能力为(54.50.68)%,而柠檬酸的总抗氧化能力下降更多,总抗氧化能力为(51.80.79)%
28、；将这几种抗氧化剂与空白对照作比较发现：TBHQ、橄榄苦苷 VC 和有极显著的抗氧化效果（ P 0.01） ，柠檬酸有显著的抗氧化效果（ P 0.05） 。0 2 4 6 8 10020406080100柠 檬 酸 VC TBHQ 200mg/kg 对 照时间/d总抗氧化能力/%图 8不同抗氧化剂的核桃油样总抗氧化能力2.5. 响应面优化实验结果2.5.1. 响应面实验设计及回归模型的建立用 Design-Expert 软件分析表 3 中的数据，并建立回归模型，得到二次回归模型方程Y=4.9-0.77A-0.063B-0.45C+0.11AB-0.14AC+0.45BC+0.73A2+0.71
29、B2+0.36C2。由表 4 可以看出，POV 模型回归显著且失拟项不显著，R 2为 0.9256，说明该方程拟合良好，能解释 92.56%数据的变异性。在因素水平范围内，各因素对 POV 值的影响顺序为：ACB。其中，A 项对 POV 值的影响达到极显著水平，C 项、A 的二次项、B 的二次项对POV 值的影响达到显著水平，表明各因素对 POV 值并不是简单的线性关系。表 3 响应面实验设计及结果试验号A（橄榄苦苷）（mg/kg）B（柠檬酸）（mg/kg）C（VC）（mg/kg）第 10 天的POV 值（mmol/kg）1 300 150 100 6.1952 200 200 200 6.285
