1、感染性克隆与反向遗传操作,感染性克隆,病毒的感染性克隆是一种对于真核细胞具有感染性 的病毒基因组全长克隆的质粒形式将病毒基因组的全长DNA或cDNA克隆整合到载体中能在E.coli中稳定存在和复制通过体外转录成RNA或直接转染后,具有感染真核细胞的能力因此，它既能在原核细胞中存在也能在真核细胞中增殖传代.,概述,反向遗传学(Reverse Genetics)是相对于经典遗传学而言的。经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律的，反向遗传学则是直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象，与之相关的各种技术统称为反向遗传学操作技术(Reverse Genetic
2、Manipulaton)。感染性克隆与反向遗传操作的发展开创了病毒研究的新时代,感染性克隆与反向遗传操作为研究病毒生命行为、致病机制以及病毒与宿主细胞间的相互作用提供了技术平台借助基因组感染性克隆来研究病毒，不再是脱离病毒整体孤立地研究单个基因、单个蛋白，而可以从整个基因组水平来研究错综复杂、相互关联的基因组合蛋白组,病毒感染性克隆发展及应用技术支撑,重组DNA技术RT-PCR技术体外转录技术人工诱变技术,病毒RNA的提取技术,异硫氰酸胍分离技术已逐渐被商品化的RNA分离试剂盒所替代试剂盒可以得到高纯度和高浓度的RNA可以减少环境污染导致的RNA降解,RT-PCR技术,两步法一步法超长RT-P
3、CR,体外、体内转录技术,体外转录技术是利用RNA聚合酶将基因组cDNA拷贝转录成RNA体内转录是将cDNA返回到RNA的过程转移到细胞内完成人工引入转录终止。又称为流产转录（runoff transcription),是人为在基因组全长cDNA克隆3端终止RNA聚合酶的合成作用,定点诱变技术,单点诱变多点诱变,体外、体内转录技术,体外转录技术是利用RNA聚合酶将基因组cDNA拷贝转录成RNA体内转录是将cDNA返回到RNA的过程转移到细胞内完成人工引入转录终止。又称为流产转录（runoff transcription),是人为在基因组全长cDNA克隆3端终止RNA聚合酶的合成作用,RNA病毒
4、的感染性克隆,DNA病毒的感染性克隆,基因组50kbDNA病毒的感染性克隆,正链RNA病毒的感染性克隆负链RNA病毒的感染性克隆 分节段与不分节段负链RNA病毒的感染性克隆,DNA病毒感染性克隆发展及应用,DNA病毒感染性克隆的产生,在1979年,Israel等在E.coli中克隆了一种小的哺乳动物病毒(polyomavirus)的全长基因组.该病毒约5kb的双链DNA基因组通过限制性酶切被连接到pBR322质粒中.当被克隆的病毒基因组DNA从E.coli载体中释放再接种小鼠或体外转染鼠细胞后均能产生病毒感染.“感染性克隆”由此产生.,已构建感染性克隆的DNA病毒,人腺病毒(HADV) , (
5、1986)杆状病毒鼠巨细胞病毒(MCMV), (1997)单疱疹病毒-1(HSV-1), (1998)猪伪狂犬病毒(PRV), (1999)人巨细胞病毒(HCMV), (1999)马立克氏病毒-1(MDV-1), (2000)几内亚猪巨细胞病毒(GPCMV), (2000)鼠疱疹病毒-68(MGHV-68), (2001)牛疱疹病毒-1(BHV-1), (2001)猕猴巨细胞病毒(RCMV), (2002)牛痘病毒(VAC), (2002),E.coli致育因子(fertility,F),F因子是一个约100kb的质粒,编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质F+性状作为染色体的标记,可以
6、高效地转移给受体细胞(F-),提示接合转移需要一个可传递的致育因子,该因子被命名为F.F因子可以整合到宿主染色体中,并且以超常的高频率转移遗传标记.,F因子的生物学特性,低拷贝数(1-2个分子/细胞)，低拷贝数加上细胞的隔绝环境,限制了细胞内质粒分子间的重组能容纳非常大。自然发生的F因子能携带1/4的E.coli染色体而不显张力或不稳定。易于操作。由于F因子呈闭环结构,所以可以用一些常规的原核基因操作技术将它直接从E.coli中分离出来。,人工染色体(artificial chromosome)的发展为DNA病毒感染性克隆与反向遗传操作的建立奠定了技术基础.,F因子的特性使其作为基因组DNA的
7、高容量载体具有独特的魅力.,1987年,克隆容量可达几百甚至上 千kb的酵母人工染色体(Yeast artificial chromosome,YAC)问世,使通过同源重组的方法在酵母中对基因组大片段的操作成为可能。但是,YAC内部存在嵌合及重组,YAC,1989年， OConner首次用“染色体建造”的方法，利用F因子构建载体pMBO131来克隆大片段DNA.,BAC,1992年, Shizuya等以pMBO131为基础,将T7、SP6启动子序列，含cosN和loxP位点的和P1噬菌体片段分别插入pMBO131中，构建了可以容纳300kb以上的载体pBAC108L，从而建立了细菌人工染色体(
8、bacterial artificial chromosome,BAC) 。,发展中的细菌人工染色体,BAC载体的基本结构,parA 、parB和parC,分裂必需的3个基因oriS决定DNA的单向复制repE编码复制所必需的蛋白质E.Cmr (氯霉素抗性基因),选择性标志基因lacZ元件,通过互补的原理区分重组子cosN和loxP，分别来源于和P1噬菌体。其中cosN可被噬菌体的末端酶切割，loxP可由P1噬菌体的Cre蛋白识别和切割,BAC载体骨架图谱,其它人工染色体,PAC：来源于P1的人工染色体 (容量300kb）HAC：哺乳动物人工染色体(容量300kb）,BAC的优点,尽管BAC的
9、容量最大仅为350kb,但可稳定遗传,无缺失、重组和嵌合现象。转化效率高（10*8-10*9转化子/g DNA）。基因组DNA容易分离和制备。,感染性克隆的构建方法(以伪狂犬病毒PrV为例),重组质粒的构建.重组质粒与病毒基因组的同源重组.重组病毒的分离、纯化.将含有伪狂犬病毒(PRV)基因组全长克隆的BAC载体转化E.coli重组缺陷型菌株DH10B.含有PRV基因组全长克隆的BAC质粒转染真核细胞PK-15.病变细胞中病毒的收获及鉴定.,PrV感染性克隆的构建流程,BAC,病毒基因组DNA,PK-15,PK-15,重组病毒基因组DNA,BAC,重组病毒基因组DNA,DH10B,含有PRV基
10、因组全长克隆的BAC质粒,含有PRV基因组全长克隆的BAC质粒,BAC,PK-15,病毒粒子,分离纯化,提取基因组,转化E.coli,提取BAC质粒,转染真核细胞,细胞病变,UL,Us,IR,TR,TK-/gG-/LacZ+,PK gG LacZ gG gD,cat,oriF,repE,parA,parB,homology,homology,UL,Us,IR,TR,BAC,BAC骨架,TK-/gG-/BAC+,提取环状基因组DNA,转化DH10B,UL,IR,TR,BAC,提取BAC质粒DNA,转染IBRS-2细胞,PrV感染性克隆的构建流程图,亲本株PrV TK-/gG-/lacZ+与含BA
11、C骨架穿梭质粒同源重组,PrVTK-/gG-/lacZ+,gG,11K,IR,PK,gG,gD,gI,gE,28K,TR,lacZ,PstI BamHI PstI,Us region,pSB301,cat,parA,repE,SphI NotI SphI oriS PstI NotI KpnI,homology,homology,parB,重组病毒PrV TK-/gG-/BAC筛选,Identification of PCR of cat gene of the recombinant virus PrV TK-/gG- containing E.coli F-plasmid sequence
12、s.M.DL-2000 marker;Lane 1. pSB301;Lane 2.PK-15 cell control; Lane3-24. viruses isolated from plaque purified.,重组病毒TK-/gG-/BAC+的 鉴定,重组病毒TK-/gG-/BAC+的PCR 鉴定,重组病毒TK-/gG-/BAC+的Southern 杂交鉴定,M 1 2 3 1 2 3,PrV TK-/gG-/BAC在组织细胞中的生物学特性,Single-step growth curves of the parent virus PRV TK-/gG-/lacZ+ and the
13、recombinant virus PRV TK-/gG-/BACVirus was harvested from cells at 2、6、12、24、48 and 72h postinfection and titers were determined by plaque assay in PK-15 cells.,闭合环状的TK-/gG-/BAC基因组转化E.coli DH10B筛选,Identification of PCR of cat gene of pTKgGBACM. DL-2000 marker; Lane 1. pSB301; Lane 2. PRV TK-/gG-/lac
14、Z+; Lane 3-14. DNA isolated from 12 bacterial clones.,PrV感染性克隆Southern杂交分析,lanes 1、2 and 3. TK-/gG-/lacZ+ 、 TK-/gG-/BAC and pTKgGBAC digested with NotI ;lanes 4、5 and 6. TK-/gG-/lacZ+ 、 TK-/gG-/BAC and pTKgGBAC digested with PstI.,BamHI酶切提取的TK-/gG-/BAC+质粒 1:Genomic DNA from infected cells 2:genomic
15、DNA from bacteria,提取的PrV Ea TK-/gG-/BAC+细菌质粒转染IBRS-2细胞,BAC-CAT PCR检测,细胞病变,BAC骨架质粒转染细胞,TK-/gG-/BAC+质粒转染细胞F1代,免疫动物技术路线,PRV亲本株TK-/gG-/lacZ+ (5104PFU）,PRV重组株TK-/gG-/BAC(5104PFU）,PRV的全长BAC DNA （50ug),转移质粒pSB301（50ug),PK-15细胞,As PrV-specific neutralizing antibodies were undetectable after immunization two
16、 times in uninfected cells-immunized and transfer plasmid-immunized mice, the titers of neutralizing antibodies of these two groups of mice were not indicated.,PrV中和抗体检测,Groups of mice were challenged i.m. with the virulent PRV-Ea strain.,PrV-BAC DNA免疫的保护力,DNA病毒感染性克隆技术的发展-定位重组系统的引入,定位重组系统是由单个多肽酶识别特定
17、的DNA序列而发生重组的遗传操作系统。研究较多的4种定位重组系统分别是噬菌体P1的Cre/loxP系统酿酒酵母的FLP/RFP系统接合酵母的R/RS系统噬菌体Mu的Gin/gix系统,Cre/loxp 位点特异性重组系统,Cre/loxP重组系统包括两个不同的成分,重组酶Cre(cause recombination)和其识别序列loxP(locus of crossing over in P1)。Cre是P1噬菌体整合酶家族中的成员,其大小为38kDa,负责调节两个loxP位点间的重组。整合酶家族重组酶的共同特点是均由单个多肽构成，作用于核苷酸序列时，不需要其它辅助因子的参与，也不额外消耗能
18、量。,loxP是34bp的DNA序列,包括一个不规则的8bp核心序列和其两侧各一个13bp的反向重复序列.,loxP回文序列结构,Cre的结构模型,Cre的N末端结构域,Cre的C末端结构域,5个螺旋,9个螺旋，2个片层,Cre与DNA结合模型,一个Cre结合到单个DNA连接臂,DNA臂的平面排列,Cre的N末端结构域和C末端结构域间由一个短链相连，两个结构域在结合位点周围形成“夹子”结构，以便与DNA分子的大小沟部位充分接触,Cre/loxP位点特异性重组途径,Cre识别的两个loxP位点可以位于不同的DNA分子。如果在同一个DNA分子上，loxP可以是同向的，也可以是反向的。当两个loxP
19、位点方向相同时，Cre介导的重组导致loxP位点间的DNA片段被删除。当两个loxP位点方向相反时， Cre介导的重组导致loxP位点间的DNA片段被倒位。如果两个loxP位点不在同一个分子上，如一个在质粒上，另一个在染色体上，Cre介导的重组可使质粒DNA片段整合到染色体上。,Cre-loxp位点特异性重组的机制,Copaul et al. Current Opinion in Structural Biology, 1999,Cre/loxP介导重组对感染性克隆构建的意义,位点特异性重组,重组酶Cre介导含有loxp序列的外源基因组DNA片断特异地整合到的BAC载体的loxp位点.BAC载
20、体的自动切除,Cre自动切除两个同一方向loxp序列间的外源基因组DNA片断后,在BAC载体中只剩余一个loxp位点,而不残留任何外源DNA序列.非同源性重组,Cre能够介导不同种DNA片断间的发生高效的重组,仅需要载体和外源片断中含有loxp序列,其两者间可以毫无同源性.可以在体内和体外以及原核和真核细胞中发挥功能.,Cre-loxP介导的重组方法(以鼠疱疹病毒-68为例),构建重组质粒,其中在BAC载体两侧各含有一个loxp序列.重组质粒与病毒基因组之间同源重组,产生含有BAC载体和两个loxp序列的重组病毒.提取环状病毒基因组,转化E.coli重组缺陷菌株DH10B.从E.coli中提取
21、含有重组病毒基因组的BAC质粒,转染成纤维细胞.细胞病变后收取病毒,再接种表达重组酶Cre的成纤维细胞.由于Cre重组酶的存在,特异性地识别并剪切基因组中两个loxp序列,释放出非基因组结构的BAC载体序列,仅保留一个loxp位点,获得不含有外源片断的完整病毒基因组.,Cre-loxp介导的重组流程,Cre,Cre/loxP在PRV感染性克隆中的应用,DNA病毒感染性克隆的应用,在E.coli中对病毒基因组进行修饰或突变,研究病毒基因的功能构建新型的病毒载体和疫苗.,ET-克隆背景知识,1998年，Stewart等报道了一种可以在大肠杆菌中应用的同源重组方法，它是通过诱导表达Rac噬菌体的Re
22、cE和RecT蛋白组合来介导的，这种技术被成为ET克隆（ET cloning）（Nat Genet, 1998)。ET克隆所需的同源臂仅为35-50bp。通过ET克隆，两端带有同源臂的供体分子能直接插入到受体DNA靶分子的同源部位。因为同源臂可以任意选择，而且不受酶切位点的限制，因此，ET克隆可以在大肠杆菌中对任意的BAC分子进行修饰，为研究基因的结构与功能提供了良好的技术支撑。,2000年，Zhang等由发现噬菌体的Red和Red蛋白组合也具有与RecE/RecT类似的功能（Nat Biotech,2000)。其他学者也有类似的报道（Yu et al,PNAS,2000;Datsenko e
23、t al,PNAS,2000）因为Red/Red和RecE/RecT所介导的同源重组机理完全相似，最近，Stewart将它们统称为Red/ET重组（Red/ET recombination),无论是RecE/RecT还是Red/Red所介导的同源重组，只有在recBCD-的大肠杆菌中才能发挥作用。其原因是recBCD具有很强的核酸外切酶活性，能够快速降解外源线形DNA分子，包括PCR产物和瓜核苷酸。因此，在应用RecE/RecT或Red/Red介导的同源重组时，必须将recBCD的主要抑制分子噬菌体的Gam蛋白（Red）进行共表达，使同源重组可以在recBCD+的大肠杆菌中才能发挥作用,ET-
24、recombination质粒图谱,Red、red和gam基因在阿拉伯糖启动子控制下,通过阿拉伯糖诱导表达.,Red/ET-recombination的作用机理,带有同源臂的供体DNA分子首先经RecE或Red作用使两端形成单链悬突，然后在RecT或Red的引导下，供体分子的同源臂单链悬突与受体分子的同源臂发生结合，最终导致供体与受体分子发生重组和置换。,ET-recombination的意义,操作简单,可以直接用PCR扩增DNA片断进行重组.筛选方便,可以通过颜色差异和抗性选择区分重组子.应用广泛,既可以介导点突变,也可以产生大片断缺失或重组.适应性强,重组片断间的同源臂仅需要30-50bp
25、,使仅知道较少序列的DNA片断间也可进行重组.重组效率高,可达10-5-10-7.,Red/ET 在BAC修饰中应用,ET-recombination的应用(以马立克氏病毒-1为例),将编码recE、recT和gam基因的重组质粒pBAD-转化DH10B,此E.coli中已含有马立克氏病毒-1的感染性克隆BAC20.PCR扩增kanr基因,在其两端的引物中均含有与马立克氏病毒-1的gB基因同源50-bp同源臂,然后转化到已含有BAC20和pBAD-的DH10B感受态细胞中,pBAD-介导PCR扩增片断与BAC20的gB基因发生重组.菌液涂于含有kanr和Cmr的平板(BAC20为Cmr),双抗
26、性选择含有kan基因而gB基因缺失的重组子.,ET-recombination的流程,1. +,DNA病毒感染性在疫苗研究中的应用,可以直接在细菌中构建可以快速获得目的基因缺失 或插入的BAC可以高通量操作,常规方法构建重组伪狂犬病毒流程图,空斑纯化,目的基因,意义：,后基因组时代，大规模研究基因功能的需要,研究伪狂犬病毒的必要性：,基因缺失活病毒疫苗,研究疱疹病毒的致病机制的模式病毒,作为载体生产多价苗,生产上,基础研究,研究神经通路的示踪物,高通量构建重组伪狂犬病毒的方法学及其应用研究,现有的高通量克隆方法：,（1）为实现专一位点重组而引入的DNA序列是固定不变的，表达时会引入几个额外的氨
27、基酸，有时会对蛋白质的表达或功能产生不利的影响；,（2）大规模应用时，体外重组反应需大量的重组酶，成本昂贵；,（3）入口克隆依然无法通量化。,不足 ：,Cre酶介导loxP位点的同源重组来介导ORF 从供体质粒到受体质粒的转移；,利用噬菌体及其大肠杆菌宿主的重组酶介导的位点专一性重组,研究方案,PRV鄂A株,含全长PRV基因组感染性的BAC载体（pPEa）的构建,通过直接连接克隆基因的pPEal载体的构建,接合介导的通用整合克隆系统的构建,利用同源重组的通用整合克隆系统的构建,供体质粒,受体质粒,受体菌株,质粒的构建,宿主菌株的改造,利用这三套系统分别克隆本实验室有的病原微生物的免疫原性基因6
28、8个，检测其有效性,将这三种方法组合，构建能表达多个基因的载体，并对载体扩容,表达研究,最终目标：将PrV的感染性克隆改造成可以随意、高通量插入的载体系统，使重组病毒的构建更快速、更便捷。,RNA病毒感染性克隆,1978年，Taniguchi首次发现将包含RNA噬菌体Q基因组全长 cDNA的质粒导入细菌后具有感染性感染性克隆（Nature, 1978)1981年，Racaniello等通过脊髓灰质炎病毒全长cDNA获得了动物病毒的感染性克隆，实现了正链RNA病毒的感染性克隆(Science, 1981)1989年，Luytjes等建立了流感病毒的感染性克隆操作系统，开创了分节段的负链RNA病毒
29、感染性克隆的研究（Cell, 1989)1994年,Schnell等构建并获得了狂犬病毒的感染性克隆，建立了不分节段的负链RNA病毒感染性克隆体系。,正链RNA病毒感染性克隆,正链RNA病毒感染性克隆的构建流程图,CSFV CWH/2003株全长基因组cDNA分子构建策略,正链RNA病毒感染性克隆的构建策略,体外转录（T7/SP6/SP3)体内转录（CMV),已构建感染性克隆的正链RNA病毒,猪瘟病毒（Ruggli et al,1996）口蹄疫病毒（Leippert et al,1997)牛病毒性腹泻（Vassilev et al,1997)马动脉炎病毒（Van Dinten et al,19
30、97)日本乙型脑炎（Gritsum et al,1998)蓝耳病病毒（Meulenberg et al,1998）猫杯状病毒（Thumfart et al,2002),影响正链RNA病毒感染性克隆构建获得的因素,扩增、克隆、转录和增殖过程的突变病毒序列在大肠杆菌中的不稳定性RNA转录产物的异质性病毒特殊结构的影响（基因组5 末端、poly(A)、帽子结构）,突变的影响,RT-PCR过程中的突变全长cDNA克隆在大肠杆菌增殖过程中的突变转录过程中的突变在被转染和动物体内的突变,有些全长转录本比亲本病毒RNA更容易产生细胞病变有利于感染的突变？,全长cDNA克隆在大肠杆菌中的不稳定性,黄热病毒和日
31、本乙型脑炎全长cDNA克隆难以获得感染性病毒的某些序列在细菌中不稳定对细菌有潜在的毒性,解决方案：,用体外连接的全长cDNA进行转录更换菌株或克隆载体改变培养温度插入嵌合内含子序列（Vladimir,2001),RNA转录本的异质性,病毒基因组在体内、体外转录时容易提前终止利用噬菌体RNA聚合酶获得的体外转录本通常只有30%是基因组长度的大量不完整的、不可复制的分子会干扰病毒的拯救,病毒特殊结构的影响,基因组5 末端碱基冗余或缺失基因组3 末端碱基冗余（非病毒核酸）poly(A)的长度帽子结构,负链RNA病毒感染性克隆,已成功构建感染性克隆的负链RNA病毒,核糖核蛋白复合体（RNPs）,对于负
32、链RNA病毒从cDNA克隆拯救感染性病毒的一个重要环节是装配功能性的核糖核蛋白复合物（Ribonucleoprotein (RNP) complex)RNPs由病毒RNA（vRNA)、核蛋白(nucleprotein)以及病毒聚合酶复合体（viral polymerase complex),Influenza A virus,不分节段的负链RNA病毒感染性克隆构建策略,分节段的负链RNA病毒,8-plasmid based system for rapid generation of influenza A viruses,操作体系的建立极大地增加了对RNA病毒进行研究的潜能，尤其便利了对一些
33、感染细胞后增殖滴度低或难以分离的RNA病毒进行研究。,RNA病毒感染性克隆的应用,探讨病毒的复制、组装和侵入机制，深入阐明病毒的致病机理。通过缺失构建嵌合病毒标志蛋白,研究基因的结构与功能,利用点突变确定与毒力相关的基因和关键的氨基酸（AIV),利用反向遗传学操作技术对RNA病毒的cDNA克隆进行点突变，已经证实乙型脑炎、委内瑞拉马脑炎等病毒一系列的毒力相关位点,The mutation of D to N at position 701 in PB2 enables DK/22 to infect and kill mice,Two rescued viruses maintained th
34、e biological properties of the wild type viruses,Genotype,PB2 of GX/35 allows GX/22 to infect and kill mice,PB2 of GX/22 attenuates GX/35 virus,The C-terminal of PB2 plays a key role for the virus replication in mice,开发减毒活疫苗与标志疫苗,Javier等利用无毒力的EAV 构建的感染性克隆，将GL基因的一个表位缺失，同时建立了针对缺失多肽的ELISA方法,开发载体疫苗,SindbisSFVKunjinNDVCSFV,The End!,
