1、肿瘤细胞运动实验技术,肿瘤细胞生物学实验室 张宁PI组,肿瘤细胞运动常用研究方法,Text in here,侵袭实验,趋化运动,实验原理 细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的影响。,划痕实验（伤口愈合实验，Scratch Assay）,操作步骤,1先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.51cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过3条线。,操作步骤,2. 在孔中加入约5105个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%；3.用10ml tip 枪头用力
2、均匀地在培养皿中划痕，PBS 洗涤2 次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。,操作步骤,4放入375%CO2培养箱培养。每3h 测量一次细胞运动的距离，拍照(具体时间依实验需要而定)。,操作步骤,5. 数据处理：每个时间点的距离长度-0 时距离=每个时间长度细胞整体迁移的距离，求出均数和标准差，时间为横轴，迁移距离为纵轴（单位mm）作图，并比较初始0 时与实验结束时实验组与对照组的照片。,注意事项,1.在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（2%）否则细胞增殖就不能忽略。 3. 按照6孔板背后画线的垂直方向划痕
3、，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。4. 实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同的细胞要观察细胞的贴壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养终止时密度适当。,实验原理 趋化运动是指细胞能够感受到外界化学物质的浓度梯度，并沿着浓度梯度的方向所做的定向运动。趋化运动是一个非常保守的过程，对于生物体的生存、生命的繁衍等具有重要的意义。,趋化运动实验（Chemotaxis Assay）,微孔小室中的趋化实验,微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞，中性粒细胞或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜而设计的。 滤膜
4、（聚碳酸脂膜）将小室分隔成上下两部分。靶细胞在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。,Boyden Chamber 装置,实验步骤,1. 在冰盒内将趋化因子由高浓度向低浓度稀释，将不同浓度的趋化因子置于趋化小室的下室，30ml/孔，每个浓度加3 个孔，其中只加BM的孔为阴性对照；2. 取对数生长期细胞，0.1%BM 重悬细胞，调整细胞浓度为5105/ml；3. 加样：下室加不同浓度的趋化因子，将膜轻轻对折后展平，光面朝下毛面朝上，依次盖上胶垫和上室将螺丝对称拧上拧紧;在上室中加入细胞，50ml/
5、孔，每个浓度加3 个孔；,实验步骤,4. 将趋化小室在 37，5% CO2 的孵化箱中孵育3h；5. 在膜的两端加上夹子，毛面在PBS 液面上蘸取，光面禁止碰到液体。毛面在架子上摩擦，再蘸取PBS，反复3 次后再蘸取一次，晾干；6. 固定, 染色,实验步骤,7. 取载玻片，剪角放在右上角，滴一滴石蜡，盖玻片封片；8. 显微镜观察计数，每孔至少 3 个随机视野，3 个孔的数值取平均值;作柱状图，纵轴趋化指数或细胞数，横轴组别；9. 趋化指数(Chemotaxis Index)=随着趋化诱导因子的浓度梯度而迁移的细胞数目/用培养基做对照的迁移细胞数目,注意事项,1. 膜，胶垫，上下小室之间防止有气
6、泡产生；2. 放膜时要对准位置，过多调整位置，易发生交叉污染。3. 枪垂直，枪尖伸入孔中下大概4/5 处，迅速加样，不要迟疑，打出液体的过程枪逐渐抬起，液体全部打出时枪尖离开液面。4. 洗膜时注意，不要把细胞面与非细胞面弄反。,肿瘤细胞侵袭试验,Matrigel Invassion Assay,Transwell 系统,Transwell 小室,0.4um孔径聚碳酯膜的扫描电镜,原理,人工重构基底膜材料Matrigel，是一种细胞外基质，4时是液体，在37 会逐渐凝固成胶状。主要成分为层黏连蛋白和型胶原，能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。,滤膜孔径一般为8mm，而
7、且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。,原理,Transwell 电镜图片,实验步骤及注意事项,1. 无菌条件下 Matrigel 于冰浴融化，用PBS（或DMEM only 培养基）稀释成1mg/ml 浓度，-20C 冻存备用；2. 取出已稀释好的 Matrigel，冰浴融化，以50ml 的体积铺于Tramwell 小室（24孔板）聚碳酸酯膜上（注意：体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），37C 放置lh，使Matrigel 聚合成凝胶（注意：加基质胶时最好将24 孔板放置在冰盒
8、上，确保胶完全覆盖孔底，不要有气泡）；,3. 每孔加入 200ml 1640（或DMEM）培养基使胶重构；4. 在 Transwell 下室中加入趋化因子或10%FBS 培养基600ml/孔；5. 在上室孔中准确加入细胞 l105 个/孔，细胞悬液体积200ml，置于5%CO2 培养箱于37C 培养24h（注意：细胞量和时间根据实验条件摸索）；6. 待培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签擦去膜上未穿过膜的细胞；,实验步骤及注意事项,7. 4%中性甲醛固定10 分钟，Giemsa 染色10 分钟，PBS 洗涤3 次，干燥，取下微孔滤膜，倒置显微镜下直接观察穿过膜的细胞(200)；8. 每张膜中央部分和周围部分各随机取 3 个视野，计数每个视野内的穿过8mm微孔的细胞数。,实验步骤及注意事项,实验结果举例,
