1、实例分析分子生物学技术的应用,-以interleukin 24为例,二、基因功能研究 1.mRNA水平和蛋白质水平表达谱 2.体外生物学活性：细胞模型，调节表达水平 细胞活力、细胞增殖、细胞周期、抑瘤活性、等等 3.体内生物学活性：抑瘤活性、成血管活性、等等,内容,一、基因的基本信息：发现、序列、染色体定位、 表达调控、同源性分子、修饰、降解、细胞内定位、 空间结构 等等,三、作用机制：信号转导途径和相互作用分子四、应用,235 documents,IF5.977.57.22.765.03.069.384.35.521.34.15.256.48,Oncogene 1995, 11: 2477-
2、2486Cancer Biol Ther 2003;2:S23S37,mda-5，mda-6 (p21)，mda-7/IL-24，mda-9/syntenin,Subtraction hybridization,一、mda-7/IL-24,Paul B. FisherColumbia Uni.,1.发现,杂交产物的克隆、筛选和测序,除去杂交体、过量探针、盐和小片段,Cancer Biol Ther 2003;2:S23S37,2.提交序列,NCBI/Genbank,3.染色体定位,Data base analysis,Cyto Growth Factor Rev. 2003, 14: 3551
3、,IL-10 Family,Mol Med. 2001;7(4):271-282,4.与IL-24同源的分子,一致的 (*)保守的 (:)相似的 (.),Cytokine Growth Factor Rev. 2003;14:3551Immunology. 2005;114(2):166-70,NCBI Blast, KEGG,5.基因的表达调控,J Cell Physiol. 2000;185(1):36-46,基因组文库,IL-24cDNA探针,PCR,测序,启动子：GCG 启动子搜索转录起始位点：引物延伸和作图,转录水平,启动子序列,J Cell Physiol. 2000;185(1)
4、:36-46,AP-1: PKC-activated TFC/EBP: growth arrest and terminal differentiation associated TF,转录起始前复合物：真核生物RNA聚合酶不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。,转录前起始复合物,拼板理论：一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性和专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,RNA聚合酶保护法,Luciferase assay system,J Cell Physiol. 2000;185(1):36-46,NdeI-N
5、heI是启动子转录活性的重要区域，C/EBP-b和cJUN/AP-1提高转录活性。,重要区域,nuclear lysates,arrow 1：C/EBP-barrow 2：AP-1,J Cell Physiol. 2000;185(1):36-46,EMSA,C/EBP-b和cJUN/AP-1结合在mda-7/IL-24启动子上。,cell lysates,IFN-和MEZ单独或联合处理不能显著改变启动子活性,Luciferase assay system,Oncogene. 2000;19(10):1362-8,3-UTR的ARE调节该基因在终末分化过程中的mRNA水平,ARE： AU-ri
6、ch elements,Luciferase assay system,Oncogene. 2000;19(10):1362-8,7.分泌蛋白,Mol Ther. 2004;9(3):355-67,Overexpression, WB,Ad.IL-24 cell lysate,Ad.IL-24 supernatant,分泌作用的抑制剂,Mol Ther. 2004;9(3):355-67,WB,Cytokine Growth Factor Rev 2003;14:3551,PNGase F: endoglycanase F endo-O: 内-O糖苷酶,6. 翻译后修饰,Overexpress
7、ion, WB,J Biol Chem. 2002;277(9):7341-7,MDA-7/IL-24蛋白可被糖基化修饰,Mol Ther. 2004;9(3):355-67,glycopeptidase F,L SN,7.细胞内定位,Mol Ther. 2004;9(3):355-67,IFC,Mol Ther. 2004;9(3):355-67,Quantitative receptor binding analysis,J Biol Chem. 2002;277(9):7341-7,IL-20R2, IL-20R1/IL-20R2, IL-22R1/IL-20R2结合AP的活性高。,8.
8、受体,J Biol Chem. 2002;277(9):7341-7,Cell surface staining assay,RT-PCR,Exp Dermat. 2006; 15: 9911004,Cancer Biol Ther. 2003;2:S23S37,RT-PCR,PC NC,Cytokine. 2008; 41: 1623,FACS,IFC,IL-22R1/IL-20R2IL-20R1/IL-20R2,Immunology. 2005;114(2):166-70,Cyto Growth Factor Rev. 2003, 14: 3551,3.前列腺 4.睾丸 5.卵巢 6.小肠
9、 7.结肠,1. mRNA表达谱：分布在人的免疫系统,NB,二、基因功能的研究,Oncogene 2001;20:70517063.,Cyto Gro Fac Rev. 2003;14:3551,：untreated +：IFN-+ MEZ , 24 h,NB,Oncogene. 2001; 20: 7051 7063,Real-time RT-PCR,在黑色素瘤恶性发展过程中，mda-7/IL-24的mRNA表达水平逐渐降低，直至完全丧失。,Pharmacol Ther. 2006;111(3):596-628,Kaplan-Meier survival analysis,Cancer Ce
10、ll Inter. 2010; 10:29,2.蛋白水平：,IHC,Cytokine. 2008; 41: 1623,类风湿关节滑膜,NC,sublining mononuclear cells,endothelial cells of blood vessels,Cytokine. 2008; 41: 1623,ELISA,免疫系统：脾、胸腺、外周血白细胞特定细胞：黑色素细胞、痣、早期黑色素瘤细胞、 平滑肌细胞、 皮肤成纤维细胞、 皮肤伤口边缘和基底类成纤维细胞样细胞 肿瘤细胞：50多种，无内源性MDA-7/IL-24蛋白表达。,分布：局限性,基因在靶细胞中的过表达,Adenovirus,J
11、 Cell Physiol. 2007;210(2):549-59,CAR检测(Coxsackie-adenovirus receptors),FACS, WB,人正常卵巢上皮细胞,卵巢癌细胞,靶细胞中重组蛋白的检测,WB,卵巢癌细胞,Mol Cancer. 2007;6(1):11,Cancer Immunol Immunother. 2007; 56:205215,7d,3.细胞活力,Crystal violet staining,Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22,TRAIL：肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体,Mol Med. 2001;7(4):2
12、71-282,Trypan blue exclusion assay,Cancer Immunol Immunother. 2007; 56:205215,Trypan blue exclusion assay,Ad.mda7能够降低肿瘤细胞的活力。,特异性抑制多种肿瘤细胞生长,4.体外抑瘤活性：细胞增殖,Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22,MTT,3H-thymidine Assay,Mol Med. 2001;7(4):271-282,Cancer Res. 2006; 66(16): 8182-8191,Colony formation,缺失信号肽
13、的突变体(SP-mda-7)具有抗瘤活性,Cancer Res. 2004; 64:29882993.,WB, MTT,Matrigel Invasion Assay, Colony formation,C8161,C8161,Cancer Res. 2004; 64:29882993.,Xenograft tumors in nude mice,5.体内抑瘤活性,SW620,Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22,Cancer Biol Ther 2003;2:S23S37,SW620,Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-
14、22,Xenograft tumors in nude mice,IHC,No Ab1,IL-24,Cancer Gene Ther. 2006; 13: 10111022,Subcutaneous SW620 tumors,抗瘤活性源自MDA-7/IL-24蛋白的表达,Mol Cancer. 2007;6(1):11,MDAH2774 tumor-bearing animal,Pharmacol Ther. 2006;111(3):596-628,特异性抑制多种肿瘤细胞生长,MDA-MB453,Cancer Immunol Immunother. 2007; 56:205215,HUVEC,
15、Oncogene. 2002 ;21(29):4558-66,5.细胞周期分析,FACS,使肿瘤细胞G2/M期阻滞,Cancer Immunol Immunother. 2007; 56:205215,WB,6.细胞凋亡,Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22,FACS analysis,PI staining,Annexin V staining,Mol Med. 2001; 7(4): 271282,FO-1 cellsSB203580：p38MARK的抑制剂,DNA Ladder,PNAS. 2002;99:1005410059.,TUNEL,PBS,
16、IL-24,Cancer Gene Ther. 2006; 13: 10111022,Subcutaneous SW620 tumors,H1299 tumor-bearing animal,Oncogene. 2002; 21: 4558 4566,IHC, TUNEL,PCR, RT-PCR,IHC, TUNEL,TUNEL,MCF7,Mol Med. 2001;7(4):271-282,Cancer Immunol Immunother. 2007; 56:205215,Caspase3 analysis,MDA-MB453,人正常卵巢上皮细胞,卵巢癌细胞,caspase-3、caspa
17、se-8和 PARP被切割,Mol Cancer. 2007;6(1):11,腺病毒感染结直肠癌细胞48h后,Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22,肺癌细胞,J Cell Physiol. 2007;210(2):549-59,具有剂量依赖效应,Z-VAD.fmk: Caspase的广谱抑制剂,Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22,保护细胞免受凋亡,与Bcl-2家族基因相关,Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22,刺激特定细胞凋亡,参与caspase9活化和自切割,腺病毒感染结直肠癌
18、细胞48h,HUVEC+Ad.mda7,HUVEC+Ad.mda7+Matrigel,Oncogene. 2002 ;21(29):4558-66,Tube formation,7.抗血管形成作用：,抑制内皮细胞形成管状结构,Oncogene. 2002 ;21(29):4558-66,血管内皮细胞标志物表达降低,H1299 tumor-bearing animals,1. p38MAPK途径,三、作用机制,Mol Cancer. 2007;6(1):11,WB,PKR: double-stranded RNA-activated protein kinase,PNAS. 2002;99(15
19、):10054-9,SB：p38MARK抑制剂p38DN：p38负显性突变体,黑色素瘤细胞FO-1,PNAS. 2002;99(15):10054-9,NB， WB,GADD：生长阻滞和DNA损伤诱导的基因,NB， WB,3d,PNAS. 2002;99(15):10054-9,Antisense, MTT,PNAS. 2002;99(15):10054-9,Ad.vec (white bars) Ad.mda-7 (black bars),p38 MAPK途径和GADD家族成员的关系,PNAS. 2002;99(15):10054-9,2. PI3K信号途径,Mol Ther. 2003;8
20、(2):207-19,H1299/Ad.mda-7+2400 cDNA,Microarray,Mol Ther. 2003;8(2):207-19,WB,H1299,Trypan blue exclusion assay,Mol Ther. 2003;8(2):207-19,Biotechniques. 2002; Suppl: 30 39.,3.选择性诱导肿瘤细胞凋亡具有多种机制,Cancer Res. 2004;64:29882993.,Cancer Res. 2003;63(23):81388144.,MDA-7蛋白诱导前列腺癌细胞凋亡的可能机制,Cancer Res. 2005; 65
21、(22): 10128-10138,四、临床应用研究,Cancer Res. 2005; 65(22): 10128-10138,Cycle1 Day30,期临床试验证明mda-7/IL-24使用安全、有临床疗效。,INGN241(重组腺病毒): Introgen公司, 期：28例; 期：进行中,INGN 241 (Ad.mda-7) treatment of a melanoma metastasis in a right supraclavicular lymph node.,Mol Ther. 2005；11, 149159,2.Ad.mda-7/IL-24与化疗药物联合使用,抗体：4D
22、5, trastuzumab , Herceptin,Her-2: human epidermal growth factor receptor-2,Her-2+转移乳腺癌,30% Her-2 +有效,Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68,Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68,FACS,Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68,Trypan blue exclusion staining,L=Ad-luc,Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68,Ad.mda
23、-7/IL24 + Herceptin,Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68,Herceptin (1 and 2 mg/ml),Trypan blue exclusion staining,MCF7,MDA-MB-453,MDA-MB-453,Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68,与Herceptin联合使用，抗瘤效果更好，并扩大抗瘤谱。,Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68,MCF-7-Her-18: Her-2-overexpressing,EGFR: epidermal grow
24、th factor-receptor,(EGFR-Wild type),Ad.mda-7 Gef,J Cell Physiol. 2007;210(2):549-59,MTT,Getinib: an orally active selective reversible inhibitor of the EGFR tyrosine kinase.,J Cell Physiol. 2007;210(2):549-59,与gefitinib联合使用，抗瘤效果提高。,J Cell Physiol. 2007;210(2):549-59,sMDA-7/IL-24,(1) 抑制血管内皮细胞成管能力,Can
25、cer Res. 2003;63(16):5105-13,3.基因工程重组MDA-7/IL-24蛋白药物,Cancer Res. 2003;63(16):5105-13,Cancer Res. 2003;63(16):5105-13,Cancer Biol Ther 2003;2:S23S37,裸鼠,Cancer Res. 2003;63(16):5105-13Mol Ther. 2005;11(5):724-33,MDA-MB4543,Cancer Immunol Immunother. 2007;56(2):205-15,具有体内抑瘤活性,Cancer Res. 2003;63(16):5
26、105-13,sMDA-7/IL-24的抗瘤活性与其受体相关,Cancer Immunol Immunother. 2007;56(2):205-15,sMDA-7/IL-24能够抑制多种肿瘤细胞增殖，并诱导凋亡,Cancer Immunol Immunother. 2007;56(2):205-15,小结：,思考题：,在日常生活中，你遇到哪些感兴趣而又不知道答案的生命科学相关问题？请用假说演绎法对其中的一个问题进行分析和探讨 。你如何理解研究思路和实验技术之间的关系？你认为在公共实验室做实验应该注意哪些问题？请从正、反两方面说明。在进行PCR实验之前，你应该做哪些准备工作？请设计将mda-7
27、基因CDS插入到真核表达载体pSecTag2A中的上下游引物。,Fig1,7. Fig2是PCR结果，每个泳道的模板不同，你如何改进PCR条件 使得A-E样品能得到特异性好的目的条带？,6.你如何评价PCR电泳结果(Fig1)？为什么？如有问题如何解决？,Fig1,8. 你用热激法将连接产物转化到细菌中，LB-Amp平板没有克隆，请分析 可能的原因。9. Western-blot实验中的影响因素有哪些？如果你得到的是没有任何条带 的白板，你准备怎么办？10.一位同学未能将PCR产物连入表达载体，请分析可能是哪些环节出问题？,11.实验室现有的试剂如下：1M Tris-HCl，1M KCl，Tr
28、iton X-100，30.5% MgCl2(MW203)；已知1反应 buffer中各试剂的浓度分别是：10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1% Triton X-100, 1.5mM MgCl2。现在要配5ml的 10反应 buffer，如何用现有试剂配制？请列出计算过程。,12. 对于一个分子生物学的关键词/术语，你有哪些想法？13. 就这次课的内容，你认为还可以从哪些角度进行mda-7/IL-24的研究？ 请说明你的理由。14. 如果你做某个实验，三次都未得到你想要的结果，你准备下一步怎么办？15. 我们实验课用过哪些仪器设备？使用时最需要注意的分别是什么？16. 请从讲课内容、时间安排和授课方式上，谈谈你对“生物化学与分子生 物学实验技术”这门课程的建议。,谢谢,
