1、2.2 动物细胞工程,1,以动物细胞培养技术为基础。,.动物细胞培养概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,2,动物细胞生长和增殖的特性：,贴壁生长,3,4,动物细胞生长和增殖的特性：,接触抑制,但癌细胞会失去接触抑制形成多层细胞。,贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂，这种现象称为接触抑制。P45,单层细胞,动物细胞培养过程,胚胎或幼龄动物的组织,细胞悬液,原代培养,传代培养,取动物组织块,5,原代培养,动物组织,10代细胞,50代细胞,6,保持细胞正常的二倍体核型,部分细胞核型可能改变；增殖缓慢甚至
2、停止,发生突变，获得不死性(无限增殖细胞系),动物细胞培养的条件 P46,无菌、无毒的环境：营养： 糖、 氨基酸、 无机盐、微量元素、促生长因子； 动物血清、血浆适宜温度、pH：气体环境：,灭菌、加抗生素，定期更换培养液,36.5 0.5； pH7.27.4,用95%空气加5%CO2的培养箱培养,动物细胞的保存：超低温（冷冻）,7,动物细胞培养应用： 理论研究：生理、病理、药理,生产有价值的蛋白质制品：如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体检测有毒物质转基因动物细胞的培养,8,9,动物细胞培养和植物组织培养的比较,细胞的全能性,细胞的增殖,液体培养基,固体培养基,动物血清、葡萄糖,植物激素、蔗糖,获得
3、细胞或细胞产品,获得植物体或细胞产品,10,动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。,2. 动物体细胞核移植技术和克隆动物,11,10代以内的细胞,供体,激活受体细胞,供、受体细胞融合,体细胞核移植的过程：,12,克隆动物过程中应用的现代生物技术： 细胞培养 核移植 细胞融合 胚胎培养 胚胎移植,核注入,胚胎培养,重组胚胎,克隆动物的原理：选择M中期卵母细胞的原因：核移植产生的克隆动物与供核亲本并非100%相同的原因：,细胞质中含有与分裂、分化有关的物质，能使重
4、组细胞发育为重组胚胎。,动物细胞核具有全能性,细胞质基因来源于受体卵母细胞,13,加速家畜遗传改良的进程,保护濒危物种,生产医用蛋白质及组织器官的移植,了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病,体细胞核移植技术的应用前景 P49,核移植胚胎干细胞,14,成功率非常低技术环节有待改进克隆动物存在健康问题克隆动物食品安全性存在争议,体细胞核移植技术存在的问题 P50,277次乳腺细胞核移植实验；获得29个发育为8细胞的“胚”；13头代孕母亲；三只羊羔出生，一只成活，即“多莉”。,15,从一个共同的祖先通过无性繁殖的方法繁殖出来的一群遗传特征相同的个体，也可用在细胞或分子水平。,克隆
5、(clone),16,细胞克隆： 由一个细胞不断分裂所形成的一大群细胞的基因型都相同。微生物克隆：由一个细菌繁殖成一个菌落。DNA分子克隆：由一个DNA分子复制产生多个子代DNA分子。,个体克隆： 不经过有性生殖，形成基因型完全相同的两个或更多的个体。,17,18,3. 动物细胞融合与单克隆抗体,概念：动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。 融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞称为杂交细胞。 P52,细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。,动物细胞融合的原理：诱导动物细胞融合的方法：,19,细胞膜的流动性,灭活的病毒，如仙台病毒
6、,物理方法化学方法生物方法：,多克隆抗体（抗血清） 获取方法：向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，从血清中分离抗体。 特点：产量低、纯度低、特异性差，是多种抗体的混合物。 P52,什么是单克隆抗体？,20,每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。,单克隆抗体： 单个杂交瘤细胞增殖产生的细胞群分泌的高度纯一的抗体。,21,需要解决的问题：使单一的B淋巴细胞在体外连续增殖,1975年，米尔斯坦（C.Milstein）和科勒（G.Khler）将B淋巴细胞与无限增殖的 骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞。 杂交瘤细胞的特点： 既能产生专一抗体，又能大量增殖。P54,单克隆抗体的制备,22,特定抗原，
7、多次免疫,多次抗体阳性筛选,融合的同种核细胞及未融合细胞,杂交瘤细胞体内培养,杂交瘤细胞体外培养,脾脏，多种，经免疫的B(效应B),单克隆抗体,选择培养基筛选,骨髓瘤细胞,多种细胞,经免疫的B淋巴细胞,23,杂交瘤细胞,能分泌专一抗体的杂交瘤细胞,细胞融合,抗原抗体反应筛选,培养液,腹水,免疫小鼠,特异性强、灵敏度高,可以大量制备,单克隆抗体的优点： P54,单克隆抗体的应用： P54,诊断用：,治疗用：,可用于多种抗原物质；结合同位素标记，还能做肿瘤等疾病的定位诊断优点：准确、高效、简易、快速,将特定的单抗与抗癌药物结合，制成“生物导弹”,24,动物细胞工程小结,25,动物细胞培养,动物细胞
8、核移植,动物细胞融合,生产单克隆抗体,原理，细胞生长特点，培养基，培养条件，过程,原代培养、传代培养；胰蛋白酶的作用,原理，供体细胞，受体细胞，克隆动物的遗传特性,原理，诱导方法，应用,原理，过程，筛选方法，特点，应用,1.植物体细胞杂交与动物细胞工程中所用的技术与原理不相符的是（ ）A.纤维素酶、果胶酶处理和胰蛋白酶处理-酶的专一性 B.植物组织培养和动物细胞培养-细胞的全能性 C.原生质体融合和动物细胞融合-生物膜的流动性 D.紫草细胞培养和杂交瘤细胞的培养-细胞分裂,26,B,2.下列关于细胞工程的叙述中错误的是（ ）A.电激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合B.去除植物细胞的细胞壁和
9、将动物组织分散成单个细胞均需酶处理C.小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫的小鼠 B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体D.某种植物甲乙两品种的体细胞杂种与甲乙两品种杂交后代的染色体数目相同,27,D,（1）该技术是在动物细胞培养技术和 技术的基础上发展起来的。（2）图中细胞A体外培养不具有分裂能力，但能分泌_，细胞B体外培养能够_。（3）动物细胞融合常用的方法是 。,3.1975年Kohler和Milstein的单克隆抗体技术在生产和使用抗体方面开创了新纪元，下图表示单克隆抗体制备流程示意图。请据图回答下列问题：,动物细胞融合,特异性抗体,无限增殖,PEG诱导（灭活的病毒、电激）,28,（4）细胞融合是随机的
10、过程，在HAT培养基中培养，要筛选出 细胞。在细胞培养过程中，为了促进细胞摄取葡萄糖，常向培养液中加入_(激素),杂交瘤,胰岛素,29,（5）培养2周后，即测定培养细胞的特征，筛选出_细胞置于不同孔内（如图所示）培养。此操作前要将培养细胞稀释到710个细胞/ml，每孔滴入0.1ml细胞稀释液，其目的是_。（6）要获得大量的单克隆抗体，可对获得的杂交瘤细胞进行_ 培养。,保证每个孔内不多于,体外或体内,分泌抗X蛋白抗体的,30,一个细胞，达到单克隆培养的目的（单一细胞培养以保证抗体的纯度）,4.科学家从某些能无限增殖细胞的细胞质中分离出无限增殖调控基因（prG），该基因能激发许多动物的细胞进行分
11、裂，这为单克隆抗体的制备提供了更为广阔的前景。请回答以下问题。（1）利用杂交瘤技术制备单克隆抗体，促进动物细胞融合常用的诱导剂是 ，诱融后需进行两次筛选，第一次筛选的目的是_，第二次筛选的目的是_。,PEG（聚乙二醇、灭活的病毒）,筛选出杂交瘤细胞,筛选出即能无限增殖又能产生所需抗体的杂交瘤细胞,31,制备重组质粒。将重组质粒导入细胞“”，所指的细胞是 ，然后进行“检测”，其目的是_。所指的细胞具有的特点是 。,（2）有人提出将无限增殖调控基因（prG）直接导入B细胞亦能获得单克隆抗体，其思路如图13所示。,经免疫的B细胞（浆细胞）,检测目的基因在受体细胞中能否表达,既能无限增殖又能产生特定抗
12、体,32,构建重组细胞时，只选用了细胞甲的细胞质是因为_。选取_的细胞核进行移植。重组细胞进行体外细胞培养时应为细胞增殖提供_等营养物质，通过细胞培养获得的细胞群称为_。,细胞甲的细胞质中有无限增殖调控基因（prG）,效应B细胞,水、无机盐、糖、氨基酸、促生长因子、动物血清,细胞系（细胞克隆）,33,（3）也有人提出用细胞核移植技术构建重组细胞来制备单克隆抗体，其思路如图14所示。,5.下图为单克隆抗体制备流程示意图。,(1)单克隆抗体制备技术的基础是_。(2)细胞融合是随机的过程，在HAT培养基中培养，目的是_。在细胞培养过程中，培养液中需要添加无机盐，但要注意无机盐的_，以保证生命活动的正
13、常进行。,动物细胞融合与动物细胞培养,筛选杂交瘤细胞,种类和数量(浓度),34,(3)为选育出能产生高特异性抗体的细胞，要将从HAT培养基上筛选出的细胞稀释到710个细胞/mL，每孔滴入0.1 mL细胞稀释液，其目的是_ _。(4)若用15N标记的氨基酸培养能产生单克隆抗体的细胞，放射性物质在细胞结构中出现的先后顺序是_。,使每个孔内不多于 一个细胞，达到单克隆培养的目的(或单一细胞培养以保证抗体的纯度),核糖体、内质网、高尔基体、细胞膜,35,杂交瘤细胞的筛选：HAT选择培养基,HAT：含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择培养基，这三种成分与细胞的DNA合成有关。DNA合成途径有两种：,36,淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。骨髓瘤细胞为代谢缺陷型，即缺乏HRPT或TK酶活性。杂交瘤细胞利用B细胞中的酶，可通过补救合成途径合成DNA。在HAT培养基中，只有杂交瘤细胞能存活。,37,
