1、抗体的纯化和检测,抗体的纯化抗体的检测,怎么纯化我们想要的抗体？,常见单抗的结构、种类、性质,每个单抗等电点、电荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性质各不相同。选择单抗的纯化方法，既要了解他们的共性，又要了解个性，从而制定相应的纯化策略(下表 3)。,单抗特性及纯化策略,纯化步骤,#抗体的纯化#,抗体 纯化的步骤,#抗体的纯化#,饱和硫酸铵沉淀法,饱和硫酸氨分级沉淀法是从溶液中分离蛋白质的常用方法。这是一种比较原始，非特异性分离技术。饱和硫酸氨沉淀法作为抗体纯化的第一步,难以得到高纯度的抗体。但是它能够浓缩和出去大部分的蛋白质，尤其是脂蛋白,#抗体的纯化#,盐离子溶液,竞争关系,溶解度,基本原理
2、,这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而被广泛应用。,水化膜,强,弱,2， 操作步骤,以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸 铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% 50% （一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ） 根据样品中的蛋白质的含量以及种类的配制饱和浓度的硫酸铵溶液来沉淀样品中的大多数蛋白质。当然这一步也有利于后边的层析。,弃上清液,蛋白成分：抗体，极少量杂蛋白，SAS,3-6个小时更换一次透析缓冲液（24-48h）,亲和层析是一种快速有效的生物活性物质的纯化方
3、法,它通过偶联蛋白对目的蛋白选择性的吸收和分离,可取得较高的纯化效果,且操作简便,广泛地应用于实验室抗体纯化。由于产品价格昂贵,使用成本较高,限制了它的运用。,Protein A/G亲和层析,Protein A A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分子量为42 KD ,有6 个不同的IgG结合位点。其中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示很强的特异性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但IgA , IgM , IgE 也可能结合在配体上,当达到饱和时,一个A 蛋白分子至少可以结合两个IgG分子。A 蛋白对IgG有高亲和力和特异性,这一特点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上清中的单克隆抗体,P
4、rotein G G蛋白是一种源自链球菌G族的细胞表面蛋白，一种三型Fc受体。其通过类似于A蛋白的非免疫机制与抗体的Fc段结合。像A蛋白一样，G蛋白与IgG 的Fc 区域特异性结合，不同的是，Protein G Sepharose 还可以特异性低亲和地与重链的CH1及轻链的C 结合而用于纯化Fab 及F(ab)2。另外，ProteinG可以广泛、更强地结合许多类型的IgG，多克隆IgG及人IgG，同时血清蛋白结合水平更低，纯度更高，配体脱落也相对更低。,重链,Protein A-Sep harose CL2-4B 亲和层析柱分离提纯IgG,Protein A-Sepharose CL24B 亲
5、和层析法的原理: A 蛋白可与IgG上的Fc 段特异性地结合,与小鼠IgG的各亚类表现为不同的结合力,结合的强弱程度依次是: IgG2a IgG2b IgG3 IgG1 。A 蛋白的这种结合也是具有p H 依赖性的,即可利用改变p H 及离子强度,纯化与其结合较弱的IgG1。,12000r，15min，去除大的凝块,将Protein A-Sep harose CL-4B 干粉溶解,再用p H 7. 4 的磷酸盐缓冲液 浸泡15min ,然后装入层析柱中。,缓冲液平衡柱子，测ph=7.4,缓冲液稀释，滤膜过滤,用ph=4.0的柠檬酸溶液洗脱抗体，再用ph=9.0的Tris-hcl缓冲液调节至7.
6、0。应用A KTA explorer100 进行监测,当观察到基线开始上升,即出现洗脱峰时,开始收集洗脱液,至洗脱峰回到基线后，使用上样缓冲液平衡柱子,采用SDS 不连续丙烯酰胺凝胶电泳,层析图及电泳结果,AKTA蛋白纯化系统,AKTA主要是根据电导率的不同级盐浓度的不同来洗脱不同的物质。系统主要分为两部分，分别是检测系统和层析柱，根据洗脱的不同的ph值来确定洗脱的物质是什么。当然全自动的AKTA系统可以多柱，多样品，多缓冲液，多组份检测，其检测功能包括多波长紫外/可见光、电导、pH、压力、温度、等等。功能很强大。,MabSelect 系列大规模抗体纯化亲和层析介质,MabSelect 是一系
7、列最新的大规模纯化抗体的亲和层析介质。它们的特点包括：更高的流速和动态载量 更低的宿主杂蛋白吸附，抗体纯度更高更低的蛋白A脱落更易于工艺的线性放大MabSelect易于清洗与除菌，寿命更长、更经济生产过程无动物血清成分,CaptoAdhere,原理：Capto Adhere介质专为治疗用抗体的分离纯化而设计，其配基 (N-Benzyl-N-methylethanolamine）综合了阴离子交换、氢键和疏水等多种复杂的作用方式，因此对于抗体的聚集体具有非常独特而高效的去除能力；此外，通过有效的实验设计 (Design of Experiment，DoE)，Capto Adhere介质还可以同时有
8、效去除泄漏的蛋白A配基、宿主蛋白、核酸、内毒素和潜在的病毒。Capto Adhere是一种流穿模式的纯化系统，能够将宿主蛋白、脱落的蛋白A和聚集体降低到很低的水平，载量可达100-200mg/ml介质，单步收率90%。此外，Capto Adhere还具有很强的病毒去除的能力。,将Mabselect SuRe和Capto Adhere相结合进行两步层析纯化。Mabselect SuRe可以达到99%的抗体纯度，亲和洗脱峰使用Captoadhere的流穿模式进行精纯: 使抗体分子流穿而聚集体、宿主蛋白、脱落的蛋白A配基等杂质结合在Adhere柱上加以去除。这样仅用两步层析就可以得到符合药用级质量要求的高纯度抗体产品，大大缩短了工艺时间，提高生产效率，同时增加了收率，降低了生产成本。,两步层析工艺,方法：冻融浓缩法原理：冻融处理后的样品，其溶质集中在浓缩管的下端，越近管底浓度越高,单克隆抗体的浓缩,单克隆抗体的检测,沉淀反应（定性）凝集试验（定性）酶联免疫法（定性）化学发光（定量）,用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。,
