1、,微生物,微生物(microorganism),结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物。例：酵母、霉菌、细菌、放线菌、病毒和小型原生动物等等微生物的利用：抗生素；酒；腐乳；污水治理,大肠杆菌的培养与分离,一、大肠杆菌（E. coli）,兼性厌氧的肠道内的共生菌群合成维生素B和维生素K，供机体利用；产生大肠杆菌素，抑制肠道致病菌和腐生菌滋生。革兰氏阴性菌,作为一种工程菌，在基因工程技术中被广泛采用。例：大规模生产治疗糖尿病的药物胰岛素,细菌的革兰氏染色,革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后
2、，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌的差别在于细胞壁的成分不同。,大肠杆菌属于革兰氏阴性菌,培养基（culture media）,按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。提供微生物生长的条件：合适的温度：25-37合适的pH：细菌 6.5-7.5 中性偏碱 真菌 5.0-6.0 中性偏酸营养成分：含有碳源、氮源、生长因子、水和无机盐。细菌喜荤，霉菌喜素,培养基内所需的其他条件,(1)pH值如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性(2)特殊营养物质如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素(3)氧气的含量如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的
3、条件,LB培养基的配方,固体培养基的配制：每50ml 液体培养基添加1g 琼脂,琼脂？,红藻中提取的多糖,在98 以上熔化，44 以下凝固，常温下凝结成有弹性的凝胶。,凝固剂,固体培养基：菌落,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。, 菌落,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,(三)无菌技术,1、获得纯净培养物的关键: 2、无菌技术 的四个方面(参看教材20页)3、消毒与灭菌,防止外来杂菌的入侵,无菌技术的四个方面,（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒 ；（2）将培养器皿、接
4、种用具和培养基等器具进行灭菌 ；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。,（1）消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。,消毒与灭菌,（2）灭菌：,灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌的过程。,1)消毒：概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。包括芽孢和孢子吗？方法:煮沸消毒法巴氏消毒法:如牛奶的消毒化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等紫外线消毒,(不包
5、括芽孢和孢子),（2）灭菌,概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法：a 灼烧灭菌 b 干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌,灼烧灭菌,微生物的接种工具 (接种环、接种针)或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧,注意适用范围,干热灭菌 160170 ；12h,能耐高温的需要保持干燥的物品( 玻璃器皿),高压蒸汽灭菌 100kPa 121 15-30min,通常用于培养基的灭菌,高压蒸汽灭菌法,高压蒸汽灭菌法为湿热灭菌法，其优点有三： 1、湿热灭菌时菌体蛋白容易变性； 2、湿热穿透力强； 3、水蒸汽变成水时可放出大量热增强杀菌效果，因此，它是效果最好的灭菌方法。,2.请你判
6、断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1） 培养细菌用的培养基与培养皿（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管（3） 实验操作者的双手,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,思考,1,二、大肠杆菌的培养和分离实验操作,（一）培养基的配置与灭菌,取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。,LB液体培养基细菌的扩大培养LB固体培养基细菌的划线分离,封口膜：既通气又不使菌进入,（二）倒平板,灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，
7、使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面,培养皿壁上不能沾有培养液，否则容易污染。,注意事项：1.培养基灭菌后，需要冷却到60 左右时，才能用来倒平板2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒 3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁操作.4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染.,（三）大肠杆菌的扩大培养,将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体培养基中,使其在37摇床培养12小时。,注意
8、事项:1.火焰旁从斜面上用接种环取菌;2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌,冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞复原.,（四）大肠杆菌的划线分离,分离方法:划线分离法和涂布分离法,平板划线分离法,平板划线的操作,不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。,进行恒温培养时，为什么要将平板倒置？,答：恒温培养时，培养基的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿会是水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放培养皿，则水分形成的水滴回落到培养基的表面并且散开。如果培养皿已形成菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。因此，恒温培养时，培养皿必须倒置。,划线分离法注意事项:1.接
9、种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.2.划线首尾不能相接3.划线后,培养皿倒置培养1224h,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始
10、处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,2、涂布分离法:是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.,划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？,划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。,五、菌种的保存,1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法,课后思考题,1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?,(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3）注意微
11、生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度,2.在培养后如何判断是否有杂菌污染?,（1）菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（2）显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法等。,3.进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?,恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。,4.实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?,所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃,5.如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的大肠杆菌所污染?,转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进行培养。,
