1、国产石蜡制作组织微阵列的探索及应用评价作者：蒋会勇，张三泉，张进华，陈愉，赵彤 【关键词】 组织病理学 【关键词】 组织微阵列；组织病理学；组织芯；原位杂交 1 方法 11 组织微阵列蜡块的制作利用病理科常用的国产石蜡（茂名市顺和蜡厂，溶点 60）制作空白蜡块作为受体蜡块，选择南方医院病理科存档的石蜡包埋组织作为供体蜡块. 首先对供体蜡块组织的 HE 切片作形态学观察，选择有代表性的区域，在相应位置进行标记；然后使用组织微阵列仪（Beecher Instruments, MTA1）制作组织微阵列. 根据原有切片标记部位，用供体针在蜡块相应部位取组织芯，其直径为 0.6 mm. 将供体组织芯放入
2、受体蜡块，每例标本在标记区域内取 2 条组织芯，在组织样本填入蜡孔时记录每个样本在二维阵列中的具体位置，并在一定位置上标记出组织微阵列的方位(图 1). 12 组织微阵列切片的制作将蜡块制好后进行切片，常面临的问题是组织的脱落. 在切片前，将石蜡组织在 45烤箱中烤 1 h，至石蜡变软，且形状没有改变为止. 用一个干净的载玻片将其表面压平,同时用玻片将石蜡从四周向中心轻轻挤压，使石蜡与组织充分接触，但不能用力过大而使组织陈列中间凸起. 处理后的阵列块即可以用于切片. 切片前置-20冰箱中冷冻 30 min. 13 组织微阵列切片的染色及观察 HE 染色：大肠组织标本制作的组织芯片按病理常规制作
3、切片,进行 HE 染色. 免疫组织化学染色：采用标准的 SP 法，进行免疫组织化学染色，DAB 显色. mRNA 原位杂交：利用PCR 法扩增并纯化 354 bp 的 KIAA1173 基因片段，纯化后的 cDNA 目的片段用 Roche 公司的 DIG DNA labeling and Detection Kit 进行随机引物地高辛标记探针. mRNA 原位杂交按照武汉博士德生物公司 Enhanced Sensitive ISH Detection Kit 操作程序进行. 14 全组织切片的染色与组织微阵列切片的染色的评价在进行组织微阵列的实验前，先对全组织切片进行免疫组织化学染色及 mRN
4、A 原位杂交，以评价微阵列的效果. 将组织微阵列与全组织切片结果一致的病例占全部病例的百分比做为诊断的符合率. 2 结果 利用普通石蜡块成功制作微阵列块 3 块，每个阵列块含 100 个组织芯，共 300 个组织芯，其中大肠组织芯 100 个 HE 染色、淋巴瘤组织芯100 个检测其 MUM1 蛋白的表达免疫组化染色、胃组织芯 100 例进行 mRNA原位杂交检测 KIAA1173 基因片段的表达情况染色效果良好. 组织微阵列与全组织切片结果比较见表 1.表 1 组织微阵列切片的染色结果（略） 3 讨论 组织芯的利用率在文献中报道最高的是 Sallinen 等1. 孙飞等2进行妊高症胎盘组织研
5、究中,点 150 个组织芯,有 146 例(97.%3)成功. 在实际应用中实验者一般会在同一组织中取数量不等的组织芯，同一组织中取得的组织芯同时脱落的概率很小，因此这种对组织芯的利用率已经能够满足大多数研究的需要. 对于临床病理研究,组织微阵列技术和全切片分析两种方法之间并没有显示多大差异，但组织微阵列在结果定量，实验方法标准化等方面有着更突出的优势，是肿瘤标本临床病理高通量分析的一个可靠的工具3. 以往制作组织微阵列需要质地较硬且可塑性较好的特种进口石蜡，价格较高. 调整石蜡硬度的工序也较麻烦，限制了其使用. 我们尝试使用病理科常用的普通石蜡制作组织微阵列，取得了良好的效果，但在制作过程中
6、应注意: 利用仪器本身的调节器来调节组织芯的间距，这样会十分均匀，可以避免打碎组织芯之间的石蜡, 使二孔融合；不应盲目追求组织芯片的密度,而缩小样本间距,这样极易造成打孔时石蜡块的碎裂, 尤其是用普通石蜡更面临这一问题. 我们在实际操作过程中，调节组织间距为 0.30.6 mm，这样一个蜡块上可以置 100200 例组织芯，可以满足大部分实验需要; 为避免石蜡的破裂，在组织阵列块的边缘留出足够的空间是很重要的，一般推荐留出 2.53 mm 边缘. 在进行组织微阵列切片时应注意: 使用蒸馏水裱片,避免水中含有任何杂质. 水温控制在 3840, 裱片最好使用恒温裱片器,捞片时速度应快，防止组织的漂
7、移； 载玻片应预先进行硅化处理，切片刀要锋利以保证每一块组织芯均能被完整切下；室温下凉干后, 在不影响下一步实验的前提下最好在 60恒温箱内过夜, 以促使组织黏附牢固，提高组织芯的利用率. 【参考文献】 1 Sallinen SL, Sallinen PK, Haapasalo HK, et al. Identification of differentially expressed genes in human gliomas by DNA microarray and tissue chip techniquesJ. Cancer Res, 2000,60:6617-6622. 2 孙飞，李东红, 尹国武，等. 组织微阵列技术分析妊高征胎盘组织中缺氧诱导因子 1 蛋白的表达J. 第四军医大学学报, 1999, 20(2):149-151. 3 Hans CP, Weisenburger DD, Greiner TCM, et al. Confirmation of the molecular classification of diffuse large Bcell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarrayJ. Blood, 2004,103:275-282.
