1、海洋来源的口蛄虾生物碱的分离纯化和抗鼻咽癌作用研究作者：叶才果，潘海燕，黄培春，何志巍【摘要】 目的从海洋来源的口蛄虾中提取并纯化该生物碱，研究其抗鼻咽癌作用。方法系统溶剂法初步分离口蛄虾乙醇粗提物，大孔树脂HP20 层析分离正丁醇洗脱的组分；对富含生物碱的组分合并后萃取总生物碱；自动层析仪纯化总生物碱，254 nm 波长检测，手动收集洗脱液；质谱仪分析生物碱分子量；MTT 方法检测药物对细胞的生长抑制率，绘制细胞生长曲线。结果大孔树脂 HP20 能非常有效地富集分离的生物碱，质谱分析纯化的生物碱 D3 分子量为 234.33。分离纯化的生物碱对鼻咽癌细胞增殖具有明显的抑制作用。结论口蛄虾来源
2、的生物碱分子量为234.33，对鼻咽癌细胞的增殖具有明显的抑制作用，并呈时间-剂量关系。【关键词】 口蛄虾； 生物碱； 鼻咽癌； 纯化Abstract：ObjectiveTo extract effective alkaloid from marine Oratosquilla materials and to study its effect on Nasopharyngeal Carcinoma cell proliferation and purify.MethodsEthanol extract from marine Oratosquilla was diluted by syste
3、m solvent. Macroporous absorption resin HP20 column chromatography was used to separate n-Butanol diluted group and total alkaloids were extracted. Auto-chromatography was employed to purify alkaloid. The purified alkaloid molecular weight was analyzed by Mass Spectrometry. MTT method was employed t
4、o investigate the inhibitory rate on cells proliferation, and growth curves were protrated at the same time. ResultsAlkaloids were mainly segregated in HP20 chromatographic diluted groups. Purified alkaloid D3 was obtained through Auto-chromatography method. Molecular weight of the purified alkaloid
5、 was 234.33 by Mass Spectrometry technique. The alkaloid D3 had obvious inhibitory effects against both CNE1 and CNE-2Z cells.ConclusionThe marine-derived alkaloid D3 has prominent anti-cancer cell proliferation effects in a time- and dose- manners, and its molecular weight is 234.33.Key words：Orato
6、squilla； Alkaloid； Nasopharyngeal carcinoma； Purification本研究所利用鼻咽癌细胞株对一批海洋生物进行药物活性筛选，发现了一些具有抑制鼻咽癌细胞系增殖，同时也可以抗 EB 病毒(Epstein-Barr Virus)增殖的海洋生物1，2 ，其中口蛄虾乙醇粗提物抑制效果最明显，并申请了中国发明专利(专利号：ZL 99102633.0)。我们以往的实验证实口蛄虾单次乙醇提取物能显著抑制人鼻咽癌细胞系 CNE1、CNE-2Z 的 DNA 合成，降低细胞活性和细胞集落形成能力（周鸿科.海洋生物1 号对人鼻咽癌细胞系 CNE-2Z 生长的影响及其机制
7、的研究.2003,广东医学院硕士学位论文） 。动物实验证明乙醇粗提物能抑制人低分化鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤的生长和转移（顾帝水.海洋生物 1 号对人鼻咽癌细胞系 CNE-2Z 转移特性及其裸鼠转移瘤的影响.2004,广东医学院硕士学位论文） 。本实验在进一步对活性组分分离纯化的基础上，结合前期的实验基础，确定活性物质的种类和分子信息正是本研究要解决的问题，以期为进一步将其开发成为有效治疗鼻咽癌的新药建立可靠的实验基础和依据。1 材料和方法1.1 细胞培养和药物筛选 CNE1 和 CNE-2Z 鼻咽癌细胞系用含 10%小牛血清的细胞培养液 RPMI-1640 常规培养(37，5CO2)。取对数生长期
8、，生长状态好的细胞用于实验。细胞接种于 96 孔培养板，每孔 200 l，1104 个细胞。设置 4 个药物浓度，分别为 50，100，200，400 g/ml，含 DMSO(0.1)的生长液为阴性对照，40 g/ml 5-Fu 作阳性对照。具体操作和检测参考文献3方法。1.2 生物碱分离纯化 采用 95食用乙醇冷浸渍法从口蛄虾中得到乙醇粗提物4 。经过系统溶剂法初步分离，大孔树脂 HP20 层析进一步分离、合并得到总生物碱，称为 D，显色方法见文献5 。自动层析仪SHQT-6A 纯化总生物碱，得组份 D1D4，纯化后得生物碱 D3。1.3 生物碱质谱分析 用分析纯的甲醇溶解配制成 1 mg/
9、ml 的液体，混悬振荡器振荡 10 min，然后 12 000 r/min 高速离心。上清液用液相色谱质谱联用仪岛津 DP8080 分析。1.4 统计学分析 实验数据资料均用s 表示，采用统计学软件SAS 8.0 进行统计学分析。分别选用直线回归法、重复测量资料的方差分析和单因素方差分析方法。2 结果2.1 纯化的生物碱对 CNE1 和 CNE-2Z 的抑制作用生物碱对CNE1、CNE-2Z 细胞均有明显的抑制作用，并呈时间剂量依赖关系。见图 1。结果显示各组间差异具有显著性(P0.01)。D3 和各组间两两比较，差异均有显著性(P0.05)。直线回归法计算各组份的 IC50 值。2.2 生物
10、碱的纯化总生物碱 D 经硅胶层析分离后的 4 个组份薄层层析展开结果如图 2 所示。D3 只有一个斑点，说明层析分离的效果比较好，可以得到较高纯度的生物碱。2.3 生物碱的质谱分析干燥的待测样品用色谱纯的甲醇溶解。D3的大部分已经溶解，离心后仍然发觉有小部分未溶解，沉淀能完全溶解在三蒸水中。质谱结果如图 3 所示。水溶解的质谱结果未显示。阿托品作为参照，经校正后的生物碱的分子量为 234.33。图 1 生物碱分离组份对 CNE1、CNE-2Z 细胞的影响（略）3 讨论生物碱是含负氧化态氮原子的环状化合物，主要分布于植物界，在动物中发现的生物碱很少。近年来，越来越多的生物碱在海洋生物中被发现，这
11、些生物碱多数来源于海洋，并且都有特异结构和生理活性。生物碱类化合物具有诱导凋亡与抑制凋亡两方面作用，分别表现在不同的疾病中，尤其在肿瘤方面的研究是目前的热点6 。图 2 薄层层析展开结果（略）图 3 阿托品 (a)和生物碱(b)标准质谱峰图（略）前期的动物实验已经证明乙醇粗提物能抑制人低分化鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤的生长和转移的基础上，进一步的实验发现海洋来源的口蛄虾提取物中醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物均具有明显抑制人低分化鼻咽癌细胞系 CNE1 和 CNE-2Z 生长的作用（数据没有显示） 。实验表明，进一步从粗提物分离提取的总生物碱 D 和纯化的单一生物碱 D3 对两种细胞系都表现出良好的抑制
12、作用，并呈时间-剂量依赖关系。口蛄虾乙醇粗提物中还含有多种物质，有糖类、苷类、蛋白多肽等物质（数据没有显示） ，那么，组份内的其它物质是否起作用或和生物碱起协同作用，仍然需要进一步的实验来验证。本实验证明 D3 具有明显的抗肿瘤活性，其 IC50值为 80 g/ml。【参考文献】1 顾帝水,黄培春,孔 霞,等.口虾蛄提取物对人鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响J.现代中西医结合杂志，2005,14（14）:1826.2 孔 霞，黄培春，李明勇，等.口虾蛄抗鼻咽癌活性成分的筛选及其对细胞周期的影响J. 宁夏医学杂志,2007,29（7）:584.3 黄全勇，黄巨恩，黄培春.MTT 法检测在不同浓度的氢化可的松下肾小管上皮细胞的活性J.医学文选，2005，24(4):459.4 汪茂田,谢培山,王忠东,等.天然有机化合物提取分离与结构鉴定M.北京:化学工业出版社,2004：8.5 赵庆春,郭 涛,张 萍，等.大孔吸附树脂分离纯化钩吻总生物碱的研究J.中国药房,2006，17(13)：969.6 Tan LT. Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discoveryJ.Phytochemistry, 2007, 68(7): 954.
