1、和营安心方对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的影响作者：李永民，王保和 邢立强，薄爱华， 吴迎爽，周宁【摘要】 目的观察和营安心方对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法以皮下大量注射异丙肾上腺素（ISO）的方法制备慢性心衰大鼠模型，随机分为模型对照组，卡托普利组，参麦注射液组，和营安心大、中、小剂量组。另设正常对照组，用 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡，用免疫组化方法检测心肌细胞 Bax，Bcl2 蛋白表达，计算 Bcl2/Bax比值。结果模型对照组 TUNEL 法心肌细胞凋亡严重，棕褐色细胞核明显增多，免疫组化图像分析 Bax 表达明显升高，Bcl2 ，Bcl2/Bax 比值明显下降。与模型对照组比
2、较，和营安心方组心肌细胞凋亡数量明显减少，Bax 蛋白表达明显下降，Bcl2 ，Bcl2/Bax 比值明显升高。结论和营安心方有减抑慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的作用。 【关键词】 和营安心方； 心力衰竭； 细胞凋亡； 血流动力学Abstract：ObjectiveTo study the effects of Heyingansxin Fang on myocardial apoptosis in chronic congestive heart failure rats.MethodsAnimal model of heart failure was induced by subcutaneo
3、usly injecting large dose of ISO and the rats were randomly divided into model group， captopril group，Shenmai injection group， high dosage of Heyinganxin Fang， middle dosage of Heyinganxin Fang ， small dosage of Heyinganxin Fang and normal group. Apoptosis was detected with TUNEL .The Bax and Bcl-2
4、proteins of cardiomyocyte were detected with immunohistochemistry and Bcl-2/Bax ratio was calculated.ResultsCompared with normal group， apoptotic cells and brown cell nucleus increased significantly in model group，the expression of Bax increased but the expression of Bcl-2 and Bcl-2/Bax ratio decrea
5、sed significantly. Compared with model group， apoptotic cells decreased significantly in Heyinganxin Fang group，expression of Bax decreased and the expression of Bcl-2 and Bcl-2/Bax ratio increased significantly.ConclusionHeyinganxin Fang has effect of inhibiting myocardial apoptosis in chronic cong
6、estive heart failure rats.Key words：Heyinganxin Fang; Congestive heart failure; Apoptosis; Hemodynamics慢性心衰属于虚劳“心损”的范畴， 难经认为“损其心者，调其营卫” ，我们宗难经之旨，确立了“调和营卫、化淤利水”的慢性心衰治则，组成和营安心方。本实验观察了和营安心方对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的影响。1 材料与方法1.1 材料雄性 Wistar 大鼠 70 只，体重 200240 g，购自河北省实验动物中心；和营安心方由西洋参 6 g，玉竹 15 g，云茯苓 15 g，桂枝 15 g，丹参
7、20 g 等组成，中剂量组水煎浓缩为 11 煎液（每毫升含生药 1 g） 、大剂量组为 12 煎液（每毫升含生药 2 g） 、小剂量组为21 煎液（每毫升含生药 0.5 g） ，药物购自北京同仁堂药店；盐酸异丙肾上腺素注射液，2 ml1 mg/支，上海禾丰制药有限公司；卡托普利，25 mg/片，常州制药厂有限公司；参麦注射液，10 ml/支，河北神威药业有限公司；MK1020 原位细胞凋亡检测试剂盒，武汉博士德生物工程公司；Bax，Bcl-2 一抗，二步法 TV6001 免疫组化检测试剂盒，北京中杉金桥生物技术公司。1.2 方法 在参考文献的基础上 1，2 ，略加改进并经预实验证实，采取皮下多
8、点注射异丙肾上腺素（ISO）的方法，第 1 天按 20 mg/kg，第 2 天按 10 mg/kg，第 312 天按 5 mg/kg 的剂量连续皮下给药，另取 11 只大鼠为正常对照组，皮下注射等量蒸馏水。造模结束后随机取2 只正常大鼠、5 只造模大鼠测定血流动力学指标，两组指标差异明显，确认模型制备成功。造模大鼠随机分为模型对照组，参麦注射液组，卡托普利组，和营安心大、中、小剂量组，每组 9 只。以人与大鼠体表面积等效剂量比折算量为和营安心中剂量组，扩大两倍为大剂量组，缩小两倍为小剂量组，每次灌胃 0.8 ml/100 g， 1 次/d；卡托普利组配成0.45%蒸馏水溶液，每次灌服 1 ml
9、/100 g；正常对照组及模型对照组灌服蒸馏水 1 ml/100g；参麦注射液组每天按 5 ml/kg 腹腔注射参麦注射液；连续给药 4 周。1.3 观测指标 1.3.1 血流动力学指标测定实验结束，大鼠腹腔注射 20%乌拉坦麻醉（1 ml/100 g） ，游离右侧颈总动脉并插入自制的心室插管（充满 1%肝素） ，通过左侧动脉瓣和房室瓣进入左心室，用多导生理记录及分析系统描记记录左室内压峰值（LVSP） 、左室舒张末压（LVEDP） 、左室内压上升、下降最大速率（dp/dtmax） 。1.3.2 心重指数开胸提起心脏，按相同位置剪断肺静脉、肺动脉、主动脉和上下腔静脉，取出心脏，分析天平称取心脏
10、重量，计算心重指数（心重 mg/体重 g） 。1.3.3 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡3纵向剪开左心室，从乳头肌处横切 0.3 cm0.5 cm 的心肌标本，置于 10%中性甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，按照试剂盒说明严格进行操作，用 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡，以细胞核染成棕褐色为阳性结果，每组每个心肌标本各取 1 张切片，每张切片计数 5 个高倍视野（400） ，计算各组每高倍视野阳性细胞数。1.3.4 心肌 Bax，Bcl-2 蛋白表达及 Bcl-2/Bax 比值按照二步法TV6001 免疫组化试剂盒的说明进行操作，每组每个心肌标本连续切片，Bax，Bcl-2
11、染色各取 1 张切片，棕褐色阳性颗粒主要表达于细胞浆，采用计算机图像分析系统进行半定量分析，摄取 400图像输入分析系统内，测定各组图像的平均灰度值，每张切片于阳性区选择 5 个无重叠视野，以灰度值大小作为待测蛋白的阳性表达指数，并计算 Bcl-2/Bax 比值。1.4 统计分析实验数据用s 表示，应用 SPSS12.0 进行统计学处理，用单因素方差分析进行组间比较。2 结果2.1 和营安心方对血流动力学、心重指数的影响结果见表 1。与正常对照组比较，模型对照组 LVEDP 明显升高，LVSP，dp/dtmax 明显降低，心重指数明显增加，差异有统计学意义（P0.01） ；与模型对照组比较，和
12、营安心方大、中剂量组 LVEDP 明显降低，LVSP，dp/dtmax 明显升高，心重指数降低，治疗效果接近卡托普利组，差异有统计学意义（P0.01 或 P0.05） ，说明和营安心方对慢性心衰血流动力学、心重指数有良好改善作用。表 1 和营安心方对血流动力学、心重指数的影响（略） 与正常对照组比较，P0.05，P0.01；与模型对照组比较，*P0.05，*P0.01 2.2 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡结果正常对照组大鼠心肌未发现细胞凋亡，模型对照组大鼠心肌细胞凋亡严重，凋亡细胞呈孤立、散在分布，数明显增多，核内有分布均匀的棕褐色颗粒，体积等于或小于正常胞核，每 2020 视野平均 3.9
13、 个；和营安心大剂量组、卡托普利组每高倍视野平均 1.5 个、1.8 个，棕褐色细胞核数量较少；和营安心中剂量组、小剂量组、参麦注射液组每高倍视野平均 2.3，2.9，2.7 个，棕褐色细胞核仍较多见。可见，各治疗组心肌细胞凋亡数明显低于模型对照组，和营安心大剂量组、卡托普利组改善慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的效果最好。2.3 和营安心方对 Bax，Bcl-2，Bcl-2/Bax 的影响结果见表 2。与正常对照组比较，模型对照组大鼠 Bax 蛋白表达明显升高，Bcl-2/Bax比值明显下降，差异有统计学意义（P0.01） ；和营安心大、中剂量组、卡托普利组与模型对照组比较，Bcl-2 蛋白表达、B
14、cl-2/Bax 比值明显升高，Bax 蛋白表达明显下降（P0.01 或 P0.05） 。表 2 和营安心方对 Bax，Bcl-2 ，Bcl-2/Bax 的影响（略） 与正常对照组比较，P0.05，P0.01；与模型对照组比较，*P0.05，*P0.01 ；n=8 3 讨论难经认为“损其心者，调其营卫” ， 内经在阐述“营卫致病”时提出了“营气衰少而卫气内伐” ，和“营气稽留，血涩不行，卫气从之”的病机，我们据此提出了慢性心衰的中医病机假说为“营卫不和，营涩卫伐，淤结水停” ，并拟定和营安心方，由西洋参、玉竹、桂枝、云茯苓、丹参等组成。西洋参、玉竹益气生津，充养营气，益营和阴；桂枝、云茯苓、丹
15、参疏卫通阳，活血化淤，宁心利水。全方补气生津，益营通卫，调和营卫，活血利水。现代药理研究表明，西洋参所含主要成分人参皂苷 Rb1，玉竹所含主要成分铃兰苷、铃兰苦苷有良好的强心作用，而方中所含桂皮醛、丹参素、丹参酮等主要有效成分对慢性心衰也有良好调节作用4 。本实验采取皮下注射 ISO 的方法复制慢性心衰大鼠模型，ISO连续 12 d 皮下注射总量达到 80 mg/kg，儿茶酚胺大量入血、持续刺激造成心肌弥漫性急性坏死2 ，模型对照组大鼠 LVSP，dp/dtmax 明显降低，LVEDP，心重指数明显升高，表明左心舒缩功能明显受损，并出现心室肥大，和营安心方大、中剂量组能明显升高 LVSP，dp
16、/dtmax，明显降低 LVEDP、心重指数，对心功能、心室肥大有良好改善作用。细胞凋亡是遗传基因控制的细胞自主性死亡过程，是机体清除严重受损的细胞、不再需要的细胞和癌变细胞的自身防御性机制，包括Bcl2 家族蛋白的调控和胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶的激活等机制。在 Bcl2 家族蛋白中，Bcl2 ，Mcl1 以及 Bclxl 均对细胞的生存起着促进作用，即抑制细胞凋亡；而 Bax，Bclxs ，bak 和 bad 则促进细胞的凋亡，即诱导细胞凋亡。Bcl2 protooncogene 是一个抑制凋亡的原癌基因，Bax protooncogene 是一个诱导细胞凋亡的原癌基因，Bax 与 Bcl
17、2 结合，阻止 Bcl2 的激活，从而促进凋亡。Bax、Bcl2是调控心肌细胞的关键凋亡基因，两者的比例决定心肌细胞在受到凋亡刺激后是死亡还是存活。慢性心衰时存在广泛的心肌细胞凋亡，其中 Bax基因表达显著升高，Bcl2 基因表达及 bcl2 /Bax 比值明显下降，细胞凋亡使心肌细胞数量减少，导致心肌细胞肥大、纤维化增生，导致心室重构。而神经内分泌激素的持续异常激活是引起细胞凋亡的重要因素，细胞凋亡是引起心肌死亡乃至心肌重构的重要原因，也是心功能下降的主要原因5 。而细胞凋亡的特征是核内 DNA 分解，产生 DNA 单链或双链缺口，TUNEL 法即是在末端脱氧核糖核酸转移酶的作用下，两种缺口
18、3OH 末端用地高辛-核苷酸标记，再用酶标记地高辛抗体予以显示，可以直接测定心肌细胞的凋亡。本实验研究表明模型对照组存在严重的心肌细胞凋亡，和营安心方能明显抑制慢性心衰时心肌细胞凋亡的发生、发展，改善血流动力学异常，减轻心重指数，进而减缓心肌重构的过程，提示和营安心方具有良好的调控慢性心衰心肌细胞凋亡的作用。【参考文献】1 沈 雁，曹洪欣，周景华. 温心胶囊对慢性心功能不全大鼠心功能和心肌基质金属蛋白酶组织抑制物1 表达的研究J. 上海中医药杂志，2005，39（5）：55.2 李为民，田 颖，孔一慧，等. 异丙基肾上腺素致大鼠心力衰竭模型的实验研究J. 哈尔滨医科大学学报，2003，37（5）：386.3 赵英强，孙兰军，李惠臻，等. 强心冲剂对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响J. 中国临床康复，2003， 7（12）：1762.4 沈丕安. 中药药理与临床应用M. 北京：人民卫生出版社，2006：98.5 付春景，郭龙辉，申 琦，等. 心肌肥大和心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及 Bax 和 Bcl2 的表达J. 郑州大学学报（医学版） ，2005，40（3）:500.
