1、荷瘤小鼠 T 细胞表面 CD59 分子的表达与 T细胞信号转导的相关性研究【关键词】 荷瘤小鼠 T 细胞 CD59 分子 T 细胞信号CD59 是一种以糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidy inositol, GPI)锚着于细胞膜表面的糖蛋白, 广泛分布于造血细胞、 非造血细胞及多种组织细胞表面, 其主要功能是调节补体活化, 通过与补体攻膜复合物（membrane attack complex, MAC）装配过程中的 C8 和/或 C9 结合从而抑制补体的活化1 。有许多研究证实, CD59 也参与 T 细胞的黏附及细胞信号的转导2 。荷瘤机体的 T 细胞往往出现活化信号转导
2、异常, 导致其功能低下, 甚至处于无反应状态3 。最近有学者研究发现 CD59在肿瘤患者的红细胞上的表达明显降低, 导致天然免疫的失衡4 。但对于荷瘤机体内 T 细胞 CD59 的表达情况及对 T 细胞活化的影响, 尚未见报道。本研究将通过建立小鼠 HeLa 细胞肿瘤模型, 对荷瘤机体 T 细胞的CD59 表达情况及对 T 细胞活化的影响进行探讨。1 材料和方法1.1 材料 HeLa 细胞致瘤模型小鼠由本课题组前期建立 ; 淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司; 纯化的 CD59 单克隆抗体（mAb）为 BD Biosciences 的产品; 荧光探针 Fluo3/AM 购自Bio
3、tium, HEPES(Solarbio); FITC 标记山羊抗小鼠 IgG(HL) 为中杉金桥公司产品, FITC 标记的抗小鼠 CD25 和 PE 标记的抗小鼠 CD4 均购自Biolegend 公司。1.2 方法1.2.1 细胞制备 取前期 HeLa 细胞致瘤的小鼠和正常对照小鼠, 无菌分离两组小鼠胸腺, 制备单细胞悬液, 淋巴细胞分层液获取单个核细胞, 再经尼龙柱处理获取 T 淋巴细胞, 苔盼蓝染色细胞活率 95%以上。调整细胞密度为 4108/L, 加入 100 mL/L 胎牛血清, 青霉素、 链霉素各 100 mL/L 的 RPMI1640 培养液 10 mL, 50 mL/L
4、CO2 、 37培养箱培养。1.2.2 T 细胞表面 CD59 表达 取 1 mL 两组 T 细胞, PBS 洗 3 遍, 滴于载玻片上吹干, 950 mL/L 乙醇固定 5 min, 吹干; 加CD59mAb(1640), 10 L, 对照加 IgG2a, 10 L, 37湿盒孵育 45 min, PBS 洗 3 遍, 5 min/次, 吹干; 加 FITC 标记的山羊抗小鼠IgG(HL) （1320）, 10 L, 37湿盒孵育 45 min, PBS 洗 3 遍, 5 min/次, 吹干; 荧光显微镜观察。荧光的检测及结果判定: 随机选取 5个视野, 根据特异荧光强弱依次用弱阳性（ ）
5、、 阳性（+） 、 强阳性（ ）表示, 无特异性荧光的用阴性（-）表示, 并根据荧光强度记分: 阴性为 0 分, 弱阳性为 1 分, 阳性为 2 分, 强阳性为 3 分。1.2.3 细胞内 Ca2+的测定 (1)Fluo3/AM 负载细胞: 取前期准备的小鼠淋巴细胞, 经苔盼蓝染色细胞活率 95以上, 调整细胞密度为5109/L, HEPES 缓冲液（pH7.4）洗 3 遍, 加 10 mol/L Fluo3/AM , 100 L, 37孵育 40 min。孵育后, 1 000 r/min, 离心 10 min, 吸弃 Fluo3/AM 上清, HEPES 缓冲液（pH7.4）洗 3 遍。加
6、0.5 mL HEPES缓冲液, 待检。(2) T 细胞内 Ca2+的测定: 使用 Nikon 激光共聚焦显微镜检测细胞内的 Ca2+, 按文献方法5检测。结果以未加处理因素前的荧光值为 100%。1.2.4 流式细胞术检测 T 淋巴细胞 CD25 表达 T 细胞中加入 1 mg/L CD59mAb, 37孵育 48 h。调整细胞密度 2108/L, 吸取 250 L不同组细胞悬液平均分放 1、 2、 3 号 EP 管中, 设置对照组和同型对照组, 加入 FITC 标记的抗小鼠 CD25, PE 标记的抗小鼠 CD4, 各 10 L, 混匀后, 4避光作用 30 min, 50 g/L 白蛋白
7、 PBS 洗 2 次, 5 min/次。多聚甲醛固定, 避光保存, 24 h 内流式细胞仪进行分析。1.2.5 统计学分析 所有数据以 xs, 两样本比较采用双样本 t检验, 全部统计处理均在 SPSS10.0 软件上进行。2 结果2.1 T 细胞 CD59 表达 分别观察对照组和实验组 T 细胞表面CD59 特异荧光的表达, 实验组荧光表达明显减弱, 差别有统计学意义（P0.05, 表 1） 。表 1 两组 T 细胞 CD59 表达的比较（略）2.2 CD59mAb 对两组 T 细胞Ca2+i 的影响 加入 CD59mAb 后, 静息 T 细胞中Ca2+i 明显升高, 1 min 正常对照组
8、即升至(452.765)%, 而荷瘤组升至（287.156）%, 两者比较差异有统计学意义（P0.01, 表 2） 。2.3 CD59mAb 作用下小鼠 T 细胞 CD25 的表达 小鼠 T 淋巴细胞静息状态下很少表达 CD25 分子, 经 CD59mAb 刺激 48 h 后, CD25 表达增加。荷瘤组 CD25 表达比正常组明显减少, 差异有统计学意义（P0.05, 图 1） 。表 2 CD59mAb 对小鼠 T 细胞Ca2+i 的影响（略）bP0.01 vs 非肿瘤模型.图 1 小鼠 T 细胞 CD25 的表达（略）3 讨论近年来研究发现, 荷瘤宿主 T 细胞信号转导缺失, 导致其功能低
9、下甚至处于无反应状态。T 细胞表达的 CD59 具有细胞信号转导的功能, 而有关其在肿瘤机体内的变化及作用机制, 尚未见报道。我们的实验显示, 荷瘤小鼠 T 细胞 CD59 的荧光表达较正常对照组减弱, 差别有统计学意义, 初步证实荷瘤小鼠 T 细胞 CD59 表达减少。为进一步研究 CD59 表达减少对 T 细胞信号转导的影响, 我们用 CD59mAb 交联 CD59, 发现Ca2+i明显升高, 且荷瘤组Ca2+i 升高幅度远低于正常组, 差异显著。Ca2+为胞内第二信使, 其与钙调蛋白（CaM）结合形成 Ca2+CaM 复合物, 激活其靶酶, 向下游传递信号6 。 Ca2+i 升高说明 C
10、D59 经特异抗体交联后产生信号, 并将其传至胞内, 且信号强弱与 T 细胞表达 CD59 的量有关。CD25 是 T 细胞中期活化抗原, 静息 T 细胞表达少, 活化后则大量诱导表达7 。我们用 CD59mAb 刺激 T 淋巴细胞表达 CD25, 结果显示, 正常小鼠 T 细胞 CD25 表达强于荷瘤小鼠 T 细胞（P0.05）, 可能是荷瘤小鼠 T 细胞 CD59 表达减少甚至缺失, 细胞信号转导受抑, 导致 T 细胞活化减少。综上结果显示, 荷瘤组 T 细胞 CD59 表达减少, 导致 T 细胞信号转导受抑、 活化减弱。CD59 在 T 细胞信号转导中发挥重要作用。【参考文献】1 Far
11、kas I, Baranyi L, Ishikawa Y, et al. CD59 blocks not only the insertion of C9 into MAC but inhibitsion channel formation by homologous C5b8 as well as C5b9 J. Physiol, 2002, 539(Pt2): 537-545.2 Korty PE, Brando C, Shevach EM, et al. CD59 functions as a signal transducing molecule for human T cell ac
12、tivationJ. Immunol, 1991, 146(2): 4092-4098.3 陈诗书. 医学细胞与分子生物学M. 上海: 上海医科大学出版社, 1995: 566.4 郭 峰, 钱宝华, 花美仙, 等. 肿瘤患者红细胞天然免疫分子CD35、 CD59 相关性研究J. 中国免疫学杂志, 2004, 20(2): 136-137.5 李明春, 雷林生, 梁东升, 等. 灵芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞浆游离 Ca2+浓度的影响J. 中国药学杂志, 1999, 34（12）: 805-807. 6 Fraser JD, Straus D, Weiss A. Signal transduction events leading to T cell lymphokine gene expressionJ. Immunol Today, 1993, 14(7): 357-362.7 GonzalezGarcia A, Merida I, Martinez AC, et al. Intermediate affinity interleukin2 receptor mediates survival via a phosphatidy linositol 3Kinasedependent pathwayJ. Biol Chem, 1997, 272(15): 10220-10226.
