1、核酸扩增技术(NAT)在血液 HBV DNA 筛查中的应用研究【关键词】核酸扩增技术(NAT) 血液 HBV DNA 筛查 输血相关传染病的预防和控制已成为全社会关注的焦点，随着检测技术的不断进步，输血传播相关病毒的危险性大大降低，目前酶免疫检测(ELTSA)技术已经广泛应用于血液筛查，但每年仍有少量新发输血后肝火病例报道，如美国无偿献血者每单位供血传播 HBV 的危险性为16.3 万。这些危险主要来自病毒感染者“窗口期”献血、病毒变异、低病毒载量感染及人工操作失误等，其中“窗口期”漏检是影响血液安全性的主要问题。核酸扩增技术(NAT)可直接检测病毒核酸，大大缩短病毒 ELISA 检测的窗口期
2、及检出变异株，发达国家已陆续将其纳入献血者的常规筛查项目，并取得一定的成效。但由于进口 NAT 试剂成本很高，取制了该技术在我国血液常规筛查中的推广应用。为了进一步提高血液的安全性，降低血液核酸筛查的成本，笔者尝试将国产 NAT 试剂应用到血液 HBV DNA 筛查中，并对在献血者 HBV DNA 检测中建立一套适合中国国情的筛查检测体系的可行性进行了探讨。 1 材料和方法 1.1 材料 RSP-200(瑞士 TECAN)及 STAR2000 全自动上海加样仪(瑞士HAMILTON)，Microlab FAME(瑞士 HAMILTON)和 DADE Behring 全自动酶免分析仪(德国 DA
3、DE)，KHB-DP1000 磁珠分离仪(上海科华)，MJ Opficon2核酸扩增检测仪(美国 Biorad)，专用耗材-96Plate，专用耗材-96Tip Comb，核酸提取试剂盒(上海的华)，HBV 检测试剂盒，HBV DNA 国家标准品(卫生部临检中心，浓度 3600IUml)， HBsAgELISA 国产试剂(上海科华)和进口试剂(美国 Abbott)，乙肝两对半试剂(厦门新创)。 1.2 检测对象 2008 年 8 月2009 年 12 月无偿献血者标本共 9239 份。NAT 筛查的标本用真空 EDTA 抗凝留取血样 5ml，于 8h 内分离血清。 1.3 血液的 ELISA
4、常规检测 所有标本均经乙肝金标试纸条和 ALT 试纸条筛查合格后，再进行 HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 国产和进口试剂两遍 ELISA 筛查及梅毒、ALT检测。 1.4 标本的汇集 将采集的 5mlEDTA 抗凝的全血室温离心 3min(3600g)，保存24冰箱中，待血液标本 ELISA 常规筛查合格后，应用 STAR2000，启动全自动汇集程序，按试剂盒要求进行 8 人份标本汇集，将每个汇集池的标本知码文件储存并输出以备追溯和确认使用。若汇集样经检检测为阳性，进行单个标本检测，以最终确认阳性标本。 1.5 标本的浓缩 往每个汇集池中加入浓缩液 40l 和促沉剂 50l，充分混匀后在
5、Eppendort 离心机以 4离心 1 小时(2500026000g)，留底部 110l左右样震荡混匀备用。 1.6 核酸的提取 采用核酸提取试剂盒，在标本处理区按试剂盒要求准备六块板，板加去抑制剂 20l、浓缩样 100l、裂解液 100l 及专用耗材-96Tip Comb，板加磁珠溶液 100l，板分别加洗涤液A、B、C200l，板加洗况液 80l，然后在 KHB-DP1000 磁珠分离仪上按程序说明逐步完成核酸提取。 1.7 核酸扩增及检测 用全自动核酸扩增仪检测，按检测试剂盒要求准备 PCR 反应液(HBV PCR 反应液 A：HBV PCR 反应液 B：HBV PCR 反诮液 C：
6、内标=8：6：1：0.2)，往反应管中加 15l PCR 反应液及 15l 已提取的核酸,置入核酸扩增检测仪上，按程序操作。内标阳性，样本阳性者报阳性。2 结果 2.1 灵敏度考评 将已知浓度的标准品用阴性血清于不同时间配制成不同拷贝数的应用标准液，进行重复核酸提取、扩增及检测，结果见表 1。 应用 Probit 概率统计(SAS9.0)计算 95检测限量及可信限范围。本方法检测 HBV DNA95检测限量为 98.0IUml，可信限范围为55.8，548。 2.2 已知 HBV DNA 阳性标本检测结果对 7 份 已知 HBV DNA 阳性的保存标本(经 Roche 试剂检测阳性)分别取样
7、1200l 离心浓缩后进行核酸提取扩增检测和 100l 直接进行核酸提取扩增检测，结果分别检也 HBV DNA 阳性 6 例和 5 例，检出率分别为85.7、72.4。采用随机双盲法混合了 7 份阳性血清(经单人份检测阴性)，进行混样检没，7 例混样中共检出 HBV DNA 阳性 2 例，检出为28.6，见表 2。 阳性、定量测定无结果 2.3 检测系统的精密性 对 68 次扩增实验的质控的 CT 值进行统计分析：计算前 20 个质控点：均值 x-=30.081，SD=1.051，CV=3.49。除了一次实验失控，CT值CT 值过高可能是质控样提取的核酸不足，导致扩增循环次数增加所致，其他实验
8、质控艾在 x-2S 范围内，见图 1。 2.4 质量控制 为监控实验进行，对整个实验进行有效控制，在每次检测过程依靠阴性、阳性对照、质控及内标进行监控。阳性质控品用来监测试剂以及实验室环境是否存在污染等可引起假阳性的系统误差及系统错误，以减少假阳性。阳性质控品用来监测试剂及整个实验过程产生假阴性的系统误差及系统性错误，以减少假阴性。内标是相当于加入每管中的阳性质控，监测每个反应体系产生假阳性的偶然误差及个体性错误，以减少标本的假阴性。阴性对照采用科华公司提供的阴性稀释血浆，质控品由科华公司提供(5104 拷贝ml)，以阴性血浆稀释成 150 拷贝ml，随样本一起检测，内标能被扩增出来，阳性对照
9、、质控均能定性检出阳性。 2.5 NAT 检测结果 共对血清学筛查合格血液 9239 人份计 1157 个汇集标本进行扩增检测，初检发现 HBV DNA 阳性汇集标本 6 个，对所有初检阳性的汇集标本进行复检，结果全部阴性，假阳性率为 0.52，本次实验未检出 HBV DNA 阳性标本。从检测阴性谍集标本中随机进行单份检测(1400l上样浓缩)，共检测 234 份，亦未检出 HBV DNA 阳性标本，见表 3。 *1157 个汇集池中有 6 个汇集池不是按 8150l 方案汇集，其中 3 个汇集池是 4150l，另外 3 个分别是6150l、3150l、2150l。在进行 HBV DNA 检测
10、，有 1 个内标检出失败。 2.6 HBsAg ELISA 阳性献血者中 HBV DNA 检测结果 对同期经 ELISA 筛查 HBsAg 阳性的标本共计 36 份进行检测，检出 HBV DNA 阳性 22 例，阳性率 61.1，对所有 HBsAg 阳性标本进行两对半检测，结果见表 4。同时对初检单试剂(ABBOTY)检测 HB-sAg 阳性的 11份标本做确认实验，结果均呈阳性反应。 3 讨论 血液 HBV 筛查模式的选择取决于该地区 HBV 的流行率，一般流行率较低的地区如欧洲、美国(3)主要规定对献血员进行 HBsAg 和抗-HBc 两项筛查，而流行率高的地区比如新加坡、台湾，由于献血人
11、群中 HBcAb 阳性率较高，对血液 HBV 筛查只检测 HBsAg 和 ALT 两项，这两种筛查模式，都能使输血传播 HBV 的危险性大大降低。但由于 HBV“窗口期” 、病毒变异、低滴度感染及 ELISA 试剂灵敏度的原因，ELISA 法筛查并不能根本排除病毒存在的危险，研究表明 HBsAg 阴性、抗-HBc 阳性的健康人群中有约 10HBV DNA 阳性，抗-HBs 和抗-HBc 阳性的健康人群中有 515HBV DNA 阳性，尽管血清中病毒载量较低。而 HBsAg 和抗-HBc 联合检测也并不能消除 HBV“窗口期”造成的漏检，资料显示 HBV 感染后最先存在血清中 HBV DNA，而
12、就算用灵敏度较高的 ELISA 试剂检测抗检测抗体也要经过 20-30 天的窗口期，因此对献血员 HBV 筛查迫切需要一种更为有效的方法，比如将可直接检测该毒核酸的 NAT 技术引入到血液常规筛查中。国外目前所开展的血液核酸筛查都是在 ELISA 筛查的基础上进行的，本次实验通过对 ELISA 检测 HBsAg 阳性标本 36 份进行 HBV DNA 检测，检出率 61.1，并对所有 HBsAg 阳性标本进行两对半检测，结果两对关检测提示具传染性的一些标本未检出 HBV DNA 阳性，可能是病毒载量低于方法的检测限量，表明在目前情况下应考虑 ELISA 和 NAT检测方法同时检测血液。目前开展
13、血液 HBV DNA 常规筛查的主要有德国和日本，他们分别采用的是 96 人份和 20 人份混合检测方案，多年来筛查 HBV 阳性率分别是 1108000 和 153976，显然 HBV 中等浪行地区的HBsAg 阴性、HBV DNA 阳性检出率较 HBV 低流行地区要高，调查显示 HBV高流行地区的 HBsAg 阴性、HBV DNA 阳性检出较 HBV 中等流行地区和低流行地区都要高。 我国是乙型肝炎的高度流行区，最近两年调查数据显示，人群中 HBsAg 携带率已上升至 10.12，在这种乙肝高流行区人群中征集健康它全的医疗用血是相当困难的，目前我国血站的血液筛查都是使用 ELISA 方法，
14、而我国的抗-HBc 阳性率高达 60，对献血员的筛查主要检测 HBsAg 和 ALT 两项，由于该方法的灵敏度较低(国产试剂盒灵敏度为0.5-1.0ngml)及病毒“窗口期”变异等原因，使得血液筛查存在一定程度的漏检，给临床用血安全带来极大的威胁。NAT 技术可直接检测病毒核酸，能缩短“窗品期”和检测病毒变异株，大大降低了 HBV 的漏检率。血清学检测 HBsAg 阴性不能排除 HBV 感染已经成为共识，1978年 Hooftingle 等首次报告抗-HBc 阳性、HBsAg 阴性的供血者可导致受血者 HBV 感染以后，大量文献报道证明了这种现象确实存在，引起输血传播 HBV 的主要是 HBs
15、Ag 阴性、HBV DNA 阳性的献血者，有研究报告在 HBV暴露率高达 7090的地区，献血员中有 719为 HBsAg 阴性 HBV感染者，而在 HBV 暴露率低的西方国家如美国约 5，献血员中仅09为 HBsAg 阴性 HBV 感染者。HBsAg 阴性 HBV 感染者的血清病毒一般保持低水平复制，抗原表达量低，HBV DNA 通常104IUml，目前所用 ELISA 试剂灵敏度难以检出。有研究证明 HBsaAg 阴性 HBV DNA 阳性血 18可导致输血后乙肝感染，而已有报道人隐匿性 HBV 感染者克隆出来的 1 个到 10 个病毒颗粒接种到猩猩身上可复制出典型 HBV 感染临床表现，
16、因此尽快推行血液核酸筛查是避免输血后 HBV 感染的有效措施。 本实验对经过 ELISA 筛查合格的献血者 9239 份标本共计 1157汇集样进行 HBV DNA 检测，结果未检出阳性标本，对从阴性谍集标本中随面拆分的 234 份标本进行单份检测，结果亦未检出 HBV DNA 阳性标本。原因可能有几个因素；无尝献血的组织动员工作保证了从低危人群中采血，血源质量高，不仅已实现 100无尝献血，而且定期献血者占献血人数 50以上，占采血量 64，是严格实施了免疫筛查，两次 ELISA检测分别采用国产和灵敏度很高的进口度剂；是所采用的 NAT 试剂灵敏度与国际同等水平相比较低，日本红十字会与 Ro
17、che 合作利用 TaqMan PCR，建立的全自动血液核酸常规筛查，其报告的 HBV DNA 灵敏度为 30拷贝ml。本实验对 7 份已知 HBV DNA 阳性的标本按浓缩和不浓缩进行检测，检出率分别为 85.7、72.4，采用随机双盲法混合 7 份阴性血清进行混样检测，检出率仅为 28.6，用国家标准品进行灵敏度考评，结果 HBV DNA95检测限量为 98.01Uml；所采用 NAT 试剂的特异性尚需提高，对 9239 份样本计 1157 个汇集样进行检测，初检假阳性率达0.52。核酸提取效率需进一步提高，对 7 份已知 HBV DNA 阳性标本取 150l 与阴性血清混样检测，离心浓缩
18、后再提取，其检出率仅为28.6，而直接取 100l 进行提取，其检出率为 72.4，显然离心浓缩病毒的作用并不大。目前国外所采用的 NAT 技术多为全自动检测系统，在核酸提取过程中加入“离心浓缩”一步，不利于整个检测系统的自动化，而且实验证明离心浓缩病毒的效果并不明显，国产 NAT 技术在病毒提取方面还有待改进。 当前我国 HBV 感染情况严峻，每年报告乙型肝炎新发病倒数红为 50 万，为保障血液安全，预防输血感染 HBV，应考虑在血液常规筛查中增加 HBV DNA 检测。国外对血液 HBV DNA 检测研究探讨较早，积累不少经验，NAT 技术较成熟，但由于试剂成本原因难以在国内得到推广应用。
19、建立一套适合中国国情的血液核酸筛查检测体系，特别是 HBV DNA 检测体系，对我国这样一个乙肝大国尤其重要。近年来虽然许多国内生物技术公司已开发出较成熟的 HBV DNA 检测产品，如深圳匹基、上海科华等，但这些产品目前只适用于临床诊断，而血液筛查和临床诊断是两个不同的领域，血液筛查对试剂的灵敏度、特异性要求比临床要求高得多。目前国产核酸试剂用于血液 HBV DNA 筛查尚处于开始阶段，需进一步积累经验，从样吕制备、扩增、检测多方面进行改进，而提高试剂灵敏度及特异性。 参 考 文 献 1叶萍.核酸扩增检测技术预防输血传染病的应用现状及研究进展.国外医学输血及血液学分册，2003，26（5）:399-402. 2白坚石.原料血浆混样 HCV/HIV-1 核酸检测的方法学研究.中国输血杂志，2003，16（3）:309-312. 3黄呈辉.核酸扩增检测在血液筛查的初步应用.中华检验医学杂志，2001，24（3）:141-143. 4Q.Meng.全自动多重检测试剂同时检测 HBV DNA，HCV RNA 和 HIV-1RNA.国外医学输血及血液学分册，2003，26（3）:280-282. 5胡兆平.荧光定量 PCR 技术在血液筛查中的应用及可行性分析.临床输血与检验，2002，4（1）:7-9.
