1、红景天对阿尔茨海默病大鼠行为学和脑组织抗氧化能力的影响作者：冀俊虎,董联玲,曹娟,杨发明,王健 【摘要】 目的 探讨红景天对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠的干预效果和作用机理。方法 采用腹腔注射 D-半乳糖(用生理盐水配成浓度为 10 mg/mL)和灌胃 AlCl3(用蒸馏水配成浓度为 20 mg/mL),并一次性注射东莨菪碱建立 AD 动物模型。通过 Morris 水迷宫测试系统检测大鼠学习记忆能力变化,抗超氧阴离子和总抗氧化能力测定检测各组大鼠脑组织抗氧化水平,常规 HE 染色和免疫组化测 A1-40 的表达,观察大鼠海马及皮质的形态学改变。用红景天以灌胃方式对实验大鼠进行干预,并以喜得镇做
2、对照观察其干预效果。结果 模型组大鼠记忆功能明显减退,神经细胞破坏明显,海马和皮质出现 -淀粉样蛋白沉积及老年斑。中药组、西药组及空白组大鼠在水迷宫测试中,逃避潜伏期明显缩短,原平台象限比、跨平台次数明显增加,与模型组比较差异有统计学意义(P0.05)；模型组抗超氧阴离子和总抗氧化能力活性较其他组明显降低(P0.05)。结论 红景天可以有效改善 AD 大鼠空间学习记忆能力损害,同时在清除自由基和抗氧化损伤方面有显著功效,具有神经保护作用。 【关键词】 红景天；阿尔茨海默病；行为学；抗氧化能力；大鼠Abstract：Objective To study the intervention effe
3、ct and mechanism of integripetal rhodiola herb (IRH) on Alzheimers disease model rats. Methods Alzheimers disease model was made by injecting D-galactose (10 mg/mL) in abdominal cavity and taking AlCl3 (20 mg/mL) by intragastric administration, and injecting scopolamine. Morris water maze testing sy
4、stem was undertaken to observe the change of learning and memory ability in rats, biochemical indicator tested was to contrast the state of oxidative stress, common HE staining and immunohistchemistry staining were to observe the morphology change of the hippcampus and cortex cell. The model rats we
5、re administrated IRH by means of intragastric administration contrasting with hydergine to compare the effect. Results The memory ability of model group was obviously decreased, cellula nervosa were damaged badly. A and senile plaques appeared on hippcampus and cortex. All of the test indexes in Mor
6、ris water maze showed that the abilities of space search, learning and memory in different groups remarkably improved compared with that of the model group (P0.05). The anti-02- and T-AC activity of the model group was lower than other groups obviously (P0.05). Conclusion IRH has significant relievi
7、ng effect on the lesion of the abilities of space search, learning and memory in AD model rats and good protecting effect on cellula nervosa of AD rats by eliminating free radical and improving the anti-oxydation potential.Key words：integripetal rhodiola herb；Alzheimers disease；ethology；anti-oxydati
8、on potential；rat阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)是一种以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的脑退行性疾病。近年来,随着老龄化进程的加速,本病已严重威胁人类生活健康,对本病的防治工作迫在眉睫。具有清热解毒、益气养血、补肾健体的中药红景天在防治痴呆、健忘方面一直备受关注。现代医学研究表明,红景天在抗氧化损伤、清除自由基和促进细胞代谢, 增强细胞活力等方面有独特的功效1,已经成为目前国内外医药界研究的热点。本实验通过建立 AD 动物模型,观察红景天的干预效果和可能作用机理,为该药防治 AD 提供实验依据。1 实验材料1.1 动物SD 雄性大鼠 60 只,山西
9、医科大学实验动物研究中心提供,体重250300 g,普通饲料饲养,自由饮水。1.2 主要药物与试剂西藏红景天购自山西医科大学第二医院中药房；甲磺酸双氢麦角毒碱片(喜得镇)由天津华金制药厂和瑞士诺华制药有限公司合作生产；D-半乳糖为 AMRESCO 公司产品,批号 D8310；结晶 AlCl3 为天津市福晨化学试剂厂产品；氢溴酸东莨菪碱为上海禾丰制药有限公司产品,批号070302；水合氯醛(分析纯)为天津市福晨化学试剂厂产品,批号20060320；考马斯亮蓝(批号 20080107)、总抗氧化能力(T-A)测试盒(批号 20080105)和抗超氧阴离子(批号 20080107)均由南京建成生物工
10、程研究所生产。兔抗大鼠 -淀粉样蛋白 1-40 (amyloid-protein 1-40,A1-40)抗体和 SABC 免疫组化试剂盒均由武汉博士德公司提供。1.3 主要仪器MT-200 Morris 水迷宫视频跟踪分析系统(S7200,成都泰盟科技有限公司)；数显恒温水浴锅(上海申腾生物技术有限公司)；低速台式离心机(上海安亭),型号：80-2C；旋涡振荡器,型号：MSI；美国 VARIAN 紫外分光光度计,型号：Cary50；电子天平(上海友声衡器有限公司)。2 实验方法2.1 药物制备红景天由山西省中医药研究院制剂室制备为干燥粉末。将 500 g红景天煎煮 3 次,第 1 次加水 2
11、500 mL,煎煮 2 h；第 2 次加水 2 000 mL,煎煮 1 h；第 3 次加水 1 500 mL,煎煮 1 h,过滤,合并 3 次提取液,80 用水浴锅蒸发浓缩成浓度为 1 g/mL 进行灌胃。2.2 造模及分组SD 雄性大鼠(60 只)经水迷宫测验试掉不符合条件者。将 52 只大鼠随机分成空白对照组(13 只)、药物造模组(39 只)。药物造模组以 50 mg/(kgd)腹腔注射 D-半乳糖和 2 mL/d 灌胃 AlCl3,持续 6 周,并进行水迷宫测试做出模型评价。模型评价标准：以空白组大鼠逃避潜伏期的均值为参考值,计算每只大鼠的平均逃避潜伏期值与参考值之差占该鼠的平均逃避潜
12、伏期时间的比值,20%则表示造模成功。将造模成功的大鼠(35只)分为模型组(11 只)、中药组(12 只)和西药组(12 只)。第 7 周开始同时给予干预：中药组用红景天灌胃,西药组用喜得镇以 1 mg/(kgd)灌胃,空白对照组以 10 mL/(kgd)蒸馏水灌胃,持续 4 周。行为学测试前 10 min对药物造模组以 2 mg/kg 腹腔注射东莨菪碱2制作 AD 大鼠复合模型。2.3 水迷宫行为学测试参照 Morris 水迷宫(Morris water maze,MWM)实验方法测定大鼠空间识别能力(包括定位航行实验和空间搜索实验)。实验室温度保持在2425 ,水迷宫中加入奶粉 1 kg,
13、用热水冲开,水面高过安全平台 1 cm,水温保持在 22 左右。先进行 5 d 定位航行实验,每日分别从 4 个象限入水进行训练,大鼠面向池壁入水,每次入水点相同,记录大鼠寻找并爬上平台所需时间(潜伏期),潜伏期上限为 60 s,每日取 4 次潜伏期平均值作为当天学习记忆成绩。第 6 日进行空间搜索实验(时间为 120 s),评价各组大鼠记忆能力的改变。2.4 生化指标的测定行为学测试完毕后处死大鼠,取半脑进行组织匀浆,采用比色法测定脑组织的总抗氧化能力和抗超氧阴离子活性,操作步骤按试剂盒说明书进行。蛋白测定采用考马斯亮蓝法。另一半脑经固定液固定后,进行海马区域切片,常规 HE 染色和 A1-
14、40 免疫组化染色,光学显微镜下观察形态学变化。3 统计学方法实验数据采用 SPSS13.0 统计软件包处理,结果采用 xs 表示,显著性检验采用方差分析,用 q 检验进行两两比较。Morris 水迷宫定位航行实验记录采用重复测量数据的多因素方差分析3。4 结果4.1 大鼠海马区域切片 HE 染色和免疫组化染色结果HE 染色结果示：空白组神经细胞排列整齐,少数细胞浓染；模型组可见小胶质细胞增多,神经细胞数量减少,细胞散失,排列不成行,组织疏松；西药组和中药组可见神经细胞普遍细长,细胞排列较规整。免疫组化染色结果示：空白组反应阴性,说明 A1-40 在正常状态下几乎不表达或表达量极少；模型组在海
15、马及皮质均可见 淀粉样蛋白沉积以及形成的老年斑,其周围可见肿胀变形的神经元；而中药组和西药组病理学改变不明显,可见少量变形的神经元细胞。4.2 Morris 水迷宫行为学测试结果(见表 1表 3)表 1 各组大鼠原平台象限游泳时间与总时间比值和跨平台次数比较(略)注：与模型组比较,*P0.05；与空白对照组比较,P0.05(下同)表 2 各组大鼠抗超氧阴离子和总抗氧化能力比较(略)表3 各组大鼠在隐藏平台实验中的平均逃避潜伏期(略)5 讨论氧化紧张为在氧自由基和/或氧化强化剂与抗氧化系统之间的不平衡。氧化紧张是一系列复杂链式事件的重要触发点,他们共同导致了神经退行性疾病的发生。有研究表明,氧化
16、紧张和氧自由基伤害是神经退行性疾病的一种主要致病因素。AD 是一种退行性的神经紊乱疾病,氧化性损伤是 AD 病理发生的最早期事件。AD 脑处于广泛的氧化紧张之下4。氧自由基的大量存在可以导致老年斑和神经纤维缠结的形成、蛋白质修饰、多肽链错误折叠、蛋白质交联、DNA 突变、脂类过氧化、膜损害等等,随后,这些变化将诱发一系列下游事件包括细胞代谢异常、神经元凋亡,从而导致记忆力减退和认知损失4。D-半乳糖致大鼠老年性痴呆主要是自由基介导的生物损伤5：D-半乳糖经氧化酶催化氧化成半乳糖醛,进一步代谢为 CO2 和木酮糖,伴随产生 O2-和 H2O2,引起氧自由基损伤。铝是一种对机体有害的化学元素,在体
17、内主要积聚于肺和脑。铝在脑内沉积可以造成学习记忆障碍。有研究证明,铝可使中枢胆碱能神经功能低下,导致学习记忆能力下降6；铝进入大脑后可诱发机体产生过量的氧自由基,进而引发脂质过氧化反应,导致细胞损伤。因此,D-半乳糖和 AlCl3 造模对脑组织形态学有明显的影响,可以导致脑内 -淀粉样蛋白沉积形成老年斑,促进 tau 蛋白异常磷酸化形成神经元纤维缠结,以及破坏细胞骨架产生神经细胞颗粒变性,甚至诱导细胞凋亡。这些变化均与老年性痴呆患者的脑病理变化相似。东莨菪碱是一种乙酰胆碱 M 受体阻断剂,可阻断大脑皮层中的乙酰胆碱受体的结合位点,引起胆碱能系统功能障碍,从而出现与 AD 一致的记忆、认知功能障
18、碍7。本实验结果表明,红景天在增强脑组织对超氧阴离子的清除和提高脑组织总抗氧化损伤方面有明显的功效；水迷宫测试表明,本药对老年性痴呆疾病的改善具有积极的作用。从而证实红景天通过清除自由基和提高脑组织的总抗氧化能力活性改善老年性痴呆的症状,然而,作为集多种有效成分于一体的红景天有着多靶点治疗的优势,其在本病中的综合作用还有待进一步研究。【参考文献】1 姜文华,孟晓婷,郝利铭,等.红景天素抗老化和抗痴呆效应的实验研究J.白求恩医科大学学报,2001,27(2)：127129.2 徐建民,俞海燕.不同剂量的东莨菪碱对大鼠学习记忆能力的影响J.苏州大学学报(医学版),2006,26(1)：5354.3
19、 胡镜清,温泽淮,赖世隆,等.Morris 水迷宫检测的记忆属性与方法学初探J.广州中医药大学学报,2000,17(2)：117119.4 盛树力.老年性痴呆及相关疾病M.北京：科学技术文献出版社,2006. 4.5 蔡大勇,黄启福,陈金星,等.丹栀逍遥散防治 D-半乳糖阿尔茨海默病的抗自由基损伤机制J.中国药师,2004,7(1)：326.6 Deloncle R, Guillard O. Mechanism of Alzheimers disease：arguments for a neurotransmitter-aluminium complex implicationJ. Neurchem Res,1990,5(12)：1239l245.7 谢 宁,宋琳莉,牛英才,等.老年性痴呆动物模型研究进展及其评价J.实验动物与比较学,2006,26(1)：5053.
