1、红景天苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用作者：颜天华 贾莹 杨伟 王秋娟 【摘要】 目的： 研究红景天苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用. 方法： 红景天苷灌胃给药 7 d 后制作大鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，观察大鼠行为学改变；取大脑并用氯化四唑（tetrazolium chloride，TTC）染色后测定梗塞百分比和含水量；进行大脑组织学检查，制作脑匀浆测定超氧化物歧化酶（SOD） 、丙二醛（MDA） 、谷胱甘肽（GSH） 、Na+K+ATP 酶、Ca2+ATP 酶，乳酸（LD）和 NO 的含量. 结果：
2、红景天苷高、中剂量组（48，24 mg/kg）均能使动物的行为学评分、梗塞百分比、脑含水量显著降低，能改善脑组织学损伤，并能明显增加 SOD，GSH 含量并降低MDA，NO，LD 含量，还能显著提高缺血再灌注后脑匀浆内 Na+K+ATP酶、Ca2+ATP 酶的活力. 结论： 红景天苷对脑缺血再灌注有一定的保护作用. 【关键词】 红景天苷；脑缺血；再灌注；保护作用 0 引言 近年来，随着临床医学上休克治疗的进展及动脉搭桥术和溶栓疗法等的推广应用，使缺血再灌注损伤的研究成为当前关注的项目之一，其中药物性保护作用也越来越受到重视. 红景天作为一种环境适应原性药物，在抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳等方面均有良
3、好的功效1. 红景天苷为红景天中主要的成分之一，有抗心肌缺血的作用2. 本实验旨在观察红景天苷在大鼠脑缺血再灌注中的保护作用. 1 材料和方法 1.1 材料红景天苷（salidroside，成都恒基医药科技有限公司，批号：20060423，纯度为 90.0%以上） ；尼莫地平（山西亚宝药业集团股份有限公司，批号：060710，20 mg/片） ；川芎嗪（河北巨龙药业有限责任公司，批号：051009，50 mg/片） ；乳酸（LD）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒、考马斯亮蓝试剂盒、ATP 酶测定试剂盒、NO 测定试剂盒（南
4、京建成生物工程研究所） ；其他试剂均为市售分析醇；SD 大鼠70 只（河南省实验动物中心） ，雄性，体质量 250350 g，清洁级，适应性饲养 3 d 后用于实验；501 型恒温水浴（上海仪器厂） ；台式干燥箱（重庆万达有限公司） ；TU1800 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）. 1.2 方法 1.2.1 动物分组将 SD 大鼠按体质量随机分为 7 组，每组 10 只，分别为假手术组：给予等量生理盐水；模型组：给予等量生理盐水；尼莫地平组： 按 1 mg/kg 给予尼莫地平；川芎嗪组：按 18 mg/kg 给予川芎嗪；红景天苷高、中、低剂量组：分别按 48，24，12 m
5、g/kg 给予红景天苷. 以上各组给药时均将药物按所需剂量溶解于生理盐水（5 mL/kg）后灌胃给药. 1.2.2 造模于实验前 7 d 开始灌胃给药，1 次/d. 第 7 日于缺血前 60 min 给药. 采用颈内动脉线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉闭塞（MCAO）模型3-4. 动物用 100 g/L 水合氯醛（300 mg/kg）皮下注射麻醉后仰卧手术台. 从颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，向外牵引二腹肌及胸锁乳突肌，由颈总动脉分叉处向头端依次游离，并注意分离伴行的迷走神经. 结扎并剪断颈外动脉的分支：枕骨下动脉和甲状腺上动脉，在颈外动脉远端结扎，切断颈外动脉使其主干游离备用，然后分离颈内动脉
6、，用丝线在颈外动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉. 将长 5 cm、直径 0.28 mm 的尼龙线经颈外动脉主干切口，缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进 18 mm 左右时感到阻力，即达到了较细的大脑前动脉内，阻断了 MCA 的所有血供来源，扎紧颈外动脉根部松扣. 缺血 1 h，拔出尼龙线，扎紧颈外动脉残端，缝合颈部切口. 假手术组大鼠麻醉后仅暴露颈内外动脉分叉，不闭塞 MCA. 每部分实验均按照相同方法分组给药及造模. 1.2.3 局灶性脑缺血 再灌注大鼠的行为学评分、梗塞百分比、脑含水量的测量术后 24 h 按 Bederson 的方法5对动物的行为缺陷进行分级
7、评分. 0 级：未观察到神经症状；1 级：提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展，紧贴胸壁；2 级：将动物置于光滑平面上，推手术侧肩向对侧移动时，阻力降低；3 级：动物自由行走时向手术对侧环转或转圈；4 级：软瘫，肢体无自发活动. MCAO 24 h 后断头处死大鼠，取出大脑，称湿质量. 在视交叉及其前后各 2 mm 处做冠状切片 5 片，于 10g/L TTC 中 37避光孵育 30 min，其中每隔 78 min翻动 1 次，再分离苍白区（梗塞区）和非苍白区（正常区） ，计算梗塞百分比. 梗塞百分比（%）= 苍白区质量/（苍白区质量+非苍白区质量）100%. 将染色后
8、的脑组织置于 110烘箱烘干，对照大脑湿质量计算脑含水量. 脑组织含水量（%）=（1脑组织干质量/脑组织湿质量）100% 1.2.4 局灶性脑缺血 再灌注大鼠脑组织学的观察动物分组、给药及手术方法同前. 于 MCAO 后 24 h 处死大鼠，取出大脑于 100 mL/L 甲醛溶液中固定. 标本于腊制模具中切片后行 HE 染色，对大脑皮层海马进行病理组织学检查. 1.2.5 局灶性脑缺血 再灌注大鼠脑匀浆生化指标的测定动物分组、给药及手术方法同前. 在 MCAO 24 h 后大鼠处死取大脑，用生理盐水制成 100g/L 匀浆，按试剂盒说明书测定大脑组织中的SOD，MDA，GSH，Na+K+ATP
9、 酶、Ca2+ATP 酶、LD 和 NO 的含量. 脑匀浆蛋白含量按考马斯亮蓝法测定. 统计学处理：实验数据用 xs 表示. 采用单因素方差分析进行组间显著性比较, 两组间样本均数比较采用 t 检验. 2 结果 2.1 红景天苷对局灶性脑缺血 再灌注大鼠的行为学评分、梗塞百分比、脑含水量的影响同假手术组相比，模型组的 MCAO 大鼠脑卒中评分、梗塞百分比和脑含水量明显增大（P0.01，表 1） ，表明造模成功. 同模型组相比，红景天苷高、中剂量组能显著降低 MCAO 大鼠的脑卒中评分，并能明显减少局灶性脑缺血大鼠脑的梗塞百分比和降低脑含水量（P0.01） ，红景天苷低剂量组与模型组比较差异无统
10、计学意义，3 个剂量随浓度增加而作用增强. 表 1 红景天苷对局灶性脑缺血 再灌注大鼠的行为学评分、梗塞百分比、脑含水量的影响 2.2 红景天苷对局灶性脑缺血 再灌注大鼠脑组织学的影响假手术组的神经元基本正常（图 1） ，核居中，未见神经元明显病变、坏死及炎细胞浸润等病理学改变. 模型组的大脑皮质神经元均见中重度变性、坏死，神经元结构模糊，胞体肿胀，尼氏小体减少或消失，出现不同程度的核深染、核固缩、核溶解，神经元数目明显减少并见筛状软化灶形成. 红景天苷高、中剂量组分别有 8，7 例脑组织未见神经元变性、坏死及炎细胞浸润等病理学改变，其他神经元见轻中度变性、坏死，神经元数目较模型组多. 红景天
11、苷低剂量组的神经元变性、坏死等病理学改变也明显减少；红景天苷各剂量组核深染、核固缩、核溶解的例数明显减少. 尼莫地平组和川芎嗪组的大部分脑组织中未见明显神经元变性、坏死及炎细胞浸润等病理学改变，神经元数目较模型组多. 2.3 红景天苷对局灶性脑缺血 再灌注大鼠脑匀浆生化指标的影响与假手术组相比，模型组的 MCAO 大鼠脑内 MDA，LD，NO 明显增多（表 2） ，GSH，SOD，Na+K+ATP 酶和 Ca2+ATP 酶的含量明显减少（P0.01）. 与模型组相比，红景天苷高、中剂量组可使局灶性脑缺血大鼠再灌注损伤的脑组织内的 MDA，LD，NO 含量显著降低（P0.01，P0.05） ，同
12、时 GSH 和 SOD 含量明显增加（P0.01，P0.05） ，显著提高 Na+K+ATP 酶和 Ca2+ATP 酶的活性（P0.01）. 而红景天苷低剂量组对生化指标无显著影响. 红景天苷 3 个剂量随浓度增加而作用增强. 同模型组相比，尼莫地平组和川芎嗪组也能显著降低脑组织内 MDA，LD，NO 的含量，增加 GSH，SOD 含量，提高 Na+K+ATP 酶和 Ca2+ATP 酶的活性（P0.01）. 3 讨论 与其他器官相比，脑循环具有高灌注、高氧耗和血流保持相对稳定的特点. 当灌流压、血容量增加时，易出现脑水肿. 这些性质决定了脑血管病具有高发病率和高致残率的特点6. 临床中风多发于
13、中动脉位置，我们采用颈内动脉线栓法制备大脑中动脉阻塞再灌注模型，损伤小，稳定性高，方法比较可靠7. 尼莫地平是二氢吡啶类钙拮抗剂，能阻滞 Ca2+ 内流，并抑制细胞内的 Ca2+释放，使细胞内的 Ca2+浓度保持在一定的水平，同时对 I/R 损伤产生的自由基有一定清除作用，尼莫地平注射液临床上已经广泛应用于急性脑梗死的治疗. 表 2 红景天苷对局灶性脑缺血 再灌注大鼠脑匀浆生化指标的影响 川芎嗪是从中药川芎根茎中提取的有效成分，能扩张动脉，改善脑循环，临床上广泛用于缺血性脑血管疾病，它能清除自由基，抑制钙超载，抑制血小板聚集. 我们研究了红景天苷抗大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤作用，结果表明红景天
14、苷 48,24,12 mg/kg 可明显改善中动脉闭塞所致局灶性脑缺血大鼠的神经功能，明显缩小梗塞面积、减轻脑水肿. 病理切片结果表明，大脑皮质锥体细胞和脑实质神经细胞的核固缩、核溶解程度比缺血对照组明显减轻. 再灌注时期，随着氧气供应的增多，自由基大量产生8. 机体内存在对抗自由基和过氧化物的防御系统,主要通过 SOD，GSH 促进自由基及 H2O2 的降解. 红景天苷能升高脑缺血再灌注大鼠脑匀浆中 SOD，GSH的含量，加快对组织超氧阴离子自由基的清除的同时使脂质过氧化产物MDA 含量显著下降. 同时，脑缺血时无氧代谢加强，大量 LD 产生和积聚引起脑组织乳酸中毒，激活神经细胞 Na+H+
15、 交换造成细胞内 Na+增多，引起细胞肿胀9. 实验结果显示红景天苷能够降低缺血脑组织中 LD含量，减轻缺血脑组织乳酸中毒状况. 细胞 ATP 酶的活性可反映细胞膜的功能，脑缺血再灌注后 ATP 酶活性的改变是神经质膜损害的标志,也是缺血后神经元继发损伤的重要环节. Na+K+ATP 酶对缺血性损伤不敏感,而对缺血再灌注(I/R)损伤则十分敏感,其与 I/R 的病理改变有密切的关系10. 脑缺血再灌注损伤后,能量耗竭, ATP 酶的活性下降, Na+K+ATP 酶活力下降导致细胞内Na+ 增高,造成细胞去极化，引起脑水肿；Ca2+ATP 酶活性的下降可加剧线粒体 Ca2+ 增高的程度，使 AT
16、P 酶活性进一步降低，能量耗竭状态加剧. 红景天苷能够明显提高缺血再灌注大鼠脑组织中 Na+K+ATP 酶和 Ca2+ATP 酶的活力从而改善脑缺血时的耗竭状态，避免进一步加重再灌注引起的细胞内钙离子超载，有利于缓解脑水肿，减轻神经元损伤11. NO 是迄今在体内发现的第一个气体性信息分子，资料表明12 ，NO在脑缺血再灌注损伤中具有双重作用：缺血早期可以增加皮质供血并具有神经保护作用；再灌注期大量产生的 NO 则具有神经毒性. 红景天苷能够显著减少大鼠脑缺血再灌注后 NO 的含量，推测其能改善再灌注期间神经细胞的损伤. 【参考文献】 1 Rongwu Y, Ge G, Ting L, et
17、al. Enhanced ability of hemoglobin to carry oxygen by salidrosideJ. Euro J Pharm, 2007, 564(1),18-25. 2 马莹，颜天华，王秋娟，等. 红景天苷对犬急性心肌缺血的保护作用J.中国药科大学学报，2007，38(6)：553-557. 3 张均田. 现代药理实验方法（下册） M. 北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998:1240-1247. 4 王鑫，肖农，周江堡，等.麻黄碱在大鼠脑缺血 再灌注损伤中的意义J.第四军医大学学报,2007,28(3):236-239. 5 王志萍，曾因
18、明.线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的研究进展J. 国外医学麻醉学与复苏分册，2005，26（3）：144-146. 6 刘素蓉，王敏，吴喜利. 复脑汤在脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用及其机制J.第四军医大学学报，2006，27(19)：1759-1761. 7 蒋海山，陆兵勋，姬仲，等. 线栓法大鼠缺血/再灌注脑损伤模型的改良J.第一军医大学学报,2004,24(10):1156-1160. 8 武国德，王欢，张廷华，等. 外源性 SOD 对脑缺血再灌注模型大鼠血清 SOD，IL6 的影响及意义J. 第四军医大学学报，2007，28(14)：1301. 9 张颖.线粒体与脑缺血神经元死
19、亡J. 微循环学杂志，2004，14(1):53 -55. 10 Duan M, Li D, Xu J, et al. Factors involved in the neuronal death during postischemic reperfusion: Experimental study in rabbitsJ. Chin Med J (Engl), 1999, 112 (2):153-156. 11 郭芳，吕平，李树民 . 大鼠全脑缺血再灌注损伤神经元 Na+, K+ 2ATP 酶 亚基的变化J.第四军医大学学报，2006，27 (18)：1675-1678. 12 Tsai SK, Hung LM , Fu YT, et al. Resveratrol neuroprotective effects during focal cerebral ischemia injury via nitric oxide mechanism in ratsJ. J Vasbular Surg, 2007,46(2): 346-353.
