1、免疫学技术有在食品安全 检测中的应用,抗原的准备抗体的制备 常用的免疫学检测技术,第一节抗原的准备,天然抗原的制备人工抗原的制备合成抗原,抗原制备的主要技术途径,天然抗原分离、纯化半抗原人工合成、载体联接抗原肽 合成、基因工程制备,天然抗原的制备,颗粒抗原的制备可溶性抗原 蛋白抗原 多糖抗原,颗粒抗原的制备,1、血红细胞抗原的制备：动物的新鲜血液+抗凝剂 离心去上清 NS悬浮 离心洗涤三次（2000转/分）,绵羊红细胞的制备流程图,4,可保存3周,取适量,NS洗涤3次2000r/min 10min,NS稀释至 25%,摇动15-20min,颗粒抗原的制备,2、细菌抗原的制备 细菌培养（37 ，
2、24小时） 杀菌（100 ，2小时） NS稀释 菌体抗原,细菌细胞抗原的制备流程图,液体培养或 斜面培养 3724h,100水浴 22.5h 杀菌,无活菌试验,NS稀释成810亿/ml,O菌体抗原,种类：蛋白质多糖和细菌毒素。细胞内存在的部位：胞外抗原和胞内抗原。胞外抗原:收集培养液或分泌物。胞内抗原:提取、分离和纯化。,可溶性抗原的分离纯化,胞内抗原的提取、分离和纯化,细胞的破碎分离纯化,1.酶处理法2.冻融法3.超声破碎法4.表面活性剂处理,细胞的破碎,1、酶处理法,常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 特点： 适用于多种微生物； 作用条件温和； 内含物成分不易受到破坏； 细胞壁损坏的程度
3、可以控制。,2、冻融法,原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破。特点：适用于组织细胞，对微生物细胞作用较差。,3、超声破碎法,原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。 超声波使用的频率从1kHz20kHz，间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。特点： 操作简单，重复性较好，节省时间； 多用于微生物和组织细胞的破碎。,4、表面活性剂处理法,原理： 在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。常用的有： 十二
4、烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子型）、新洁尔灭等。应用： 破碎细菌，且作用比较温和。,抗原的纯化,1.超速离心法2.选择性沉淀法3.凝胶层析法4.离子交换层析法5.亲合层析法,1、超速离心法,原理: 利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。应用： 用于少部分大分子抗原和一些比较轻的抗原物质的分离，如IgM、载脂蛋白A、B等。,2、选择性沉淀法,原理： 根据蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。常用方法： 盐析沉淀法（不同盐浓度则溶
5、解度不同），常用3350饱和度的硫酸胺。特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。,3、凝胶层析法,原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，由于分子大小的不同先后被洗脱出来，从而实现对不同分子大小的物质进行分离。常用的如：如葡聚糖凝胶填料（sephadex 柱）,凝胶层析（分子筛）,4、离子交换层析法,原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离
6、子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位 置，从而使血清中的蛋白质分成球蛋白、球蛋白、球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。,离子交换层析,5、亲和层析法,原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗IgG)结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的Ig洗脱下来，达到纯化的目的。优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。,正常细胞 ,标记细胞洗滴,标记细胞被酶裂解,加入特异性抗体,其它蛋白洗涤流失,SDS-PAGE分离蛋白,亲和层析法示意图,亲和层析,
7、抗原的鉴定,1.含量鉴定：凯氏定氮法 2.理化性质鉴定 凝胶层析技术测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶管状电泳 超速离心3.纯度鉴定 常用醋酸纤维膜电泳 4.免疫活性鉴定 常用双向琼脂扩散试验,半抗原免疫原的制备,1.半抗原： 低分子量的化学物质。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物(包括抗生素）及其他化学物品等。2.载体：蛋白质类 多肽聚合物 大分子聚合物3.半抗原-载体连接方法,半抗原,+,载体,抗体,完全抗原,载体类型,1.蛋白质： 人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。2.多肽聚合物： 人工合成的，常见的有多聚赖 氨酸，其分子量大（可达十几万到几十
8、万)，这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动物产生高效价、高亲和力的抗体。3.大聚合物： 羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦可诱发动物产生抗体。,半抗原-载体连接方法1,碳化二亚胺法：,R-NH=CH-R,半抗原载体蛋白质,搅拌12h,室温24h,透析除去未反应的半抗原,人工免疫原,半抗原载体连接方法1,混合,混合,戊二醛法:,半抗原-NH2,载体蛋白-NH2,半抗原-N=CH-(CH2)3-CH=NH-载体蛋白,OHC-(CH2)3-CHO,*戊二醛是常用的带有两个活性基团的双 功能联接剂,半抗原载体连接方法2,半抗原-载体连接方法3,氯甲酸异丁脂法：,半抗原
9、-COOH,载体蛋白-NH2,Cl-COO-CH2CH(CH3)2,半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2,半抗原-CO-NH-载体蛋白,半抗原载体连接方法3,简便，用于类固醇抗原制备,HO-CH2CH(CH3)2,半抗原-载体连接方法4,琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制备,半抗原-CH2OH,CH2-CO CH2-CO,带羧基的半抗原琥珀酸衍生物,半抗原-CH2-OOC-CH2-CH2-COOH,吡啶,再经氯甲酸异丁脂法或碳化二亚胺法制备载体半抗原,半抗原载体连接方法4,佐剂,概念： 能非特异地通过物理或化学方法与抗原结合从而增强其特异性免疫原性的物质。条件：增加抗原的表面积；
10、改变抗原的活性基团构型；佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间； 可直接或间接激活免疫活性细胞 ；无毒性或无副作用。,（二）常用佐剂的种类和制备,1.氢氧化铝佐剂：,5%硫酸铝,5%氢氧化钠,氢氧化铝沉淀,制成悬液即为佐剂,强烈搅拌,NS洗二次,NS,等体积抗原,免疫接种,常用佐剂的种类及制备,2.明矾佐剂,10%硫酸钾铝,氢氧化钠校正pH值至6.5,沉淀,乳状悬液,* 明矾佐剂抗原常用于肌肉注射，皮下注射 易引起肉芽种和脓肿。,NS搅拌,NS洗二次,离心,抗原,备用,防腐剂,作用大于不完全佐剂局部形成肉芽种和溃疡不能用于人体,弗氏完全佐剂,3.弗氏佐剂(Freund adjuvant)
11、,液体石蜡,完全乳化,备用,高压灭菌,加热,抗原,弗氏不完全佐剂,卡介苗,羊毛脂,鉴定,一滴乳剂,乳剂不散浮于液面,水中,混合,增强抗原对机体的免疫原性； 增强抗体的产生能力； 为制备出高效价的免疫血清； 在某种情况下，改变Ag免疫应答类型； 延长抗原在免疫动物的时间； 增强局部对变应原的超敏反情况。,佐剂的作用,人工抗原及基因工程抗原,用化学合成法或基因重组法制备含有已知化学结构决定簇的抗原，称之为人工抗原。它可包括人工结合抗原、人工合成抗原和基因重组抗原。,人工合成抗原,用化学方法将活化氨基酸聚合，使之成为合成多肽。应用这种人工合成多肽可作为抗原。只由一种氨基酸形成的聚合体称为同聚多肽，如
12、由左旋赖氨酸形成的同聚多肽。由二种或二种以上氨基酸形成的聚合多肽称为共聚多肽，如由酪氨酸、谷氨酸与多聚丙氨酸和赖氨酸组成的聚合成多肽。,基因工程抗原,将编码免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并与适当载体DNA分子相结合，然后引入受体细胞中使之表达，即能获得免疫原性之融合蛋白，经纯化后即基因工程疫苗。 基因工程乙型肝炎病毒疫苗和在牛痘苗表达系统中研制乙肝病毒的重组感染载体的多价疫苗。,小结,抗原的种类颗粒性抗原的制备可溶性抗原提取分离纯化方法抗原的鉴定半抗原免疫原的制备佐剂的作用,第二节 抗体的制备,多克隆抗体的制备单克隆抗体技术基因工程抗体,多克隆抗体的制备,1.免疫动物选择2.免疫方法3.动物采
13、血法4.免疫血清的分离及保存,免疫动物的选择,能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。免疫动物的选择原则：1.抗原与免疫动物种属差异越远越好；2.动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、 体重合乎要求；3.不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫应答；4.按需要量选择大小不同的动物。,免疫方法,1.免疫原的注射剂量2.免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉 腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌3.免疫方案 全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射 微量免疫法：卡介苗 弗氏佐剂 抗原 混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉,7天,1月,1.颈动脉放血法2.心脏采血法3.静脉采血法,动物采血法,免
14、疫血清的分离和保存,免疫血清的分离 1、室温自然凝固，然后放置37或4待凝 块收缩，分离血清。 2、 抗血清分出后要经5630min灭活。免疫血清的保存 1.4保存：可保存36个月 2.低温保存：-20-40，可保存23年 3.冰冻干燥保存：可保存35年,特异性抗体的纯化,1.亲合层析法：将交叉抗原交联到Sepharose 上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层 析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异 性抗体。2.吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直 接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上 清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。,特异性IgG抗体的纯化,1.盐吸沉淀法：经硫酸铵盐析提取球蛋白 3次
15、，基本为IgG类抗体，但不纯。2.A蛋白亲和层析：SPA与IgG的Fc段有很强的 特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地 与抗体结合，一个A蛋白至少可以结合二个 IgG分子。适合纯化细胞培养上清中的McAb。3.其它：凝胶过滤、离子交换层析等,特异性抗体的鉴定,1.抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定2.抗体特异性鉴定 细菌类抗原的抗体用凝集试验 可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验3.抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法4.抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好,亲合力,亲合力是指抗体与结合抗原的活度或牢固度。抗体与抗原结合疏松，结合后会迅速解离，称为亲合力低，反之，亲合力高。亲合力的高低是由抗原分子的大小
16、，抗体分子的结合位点与抗原的决定基之间的立体结构型的合适程度决定的。亲合力常以亲合常数K表示。K的单位是升/摩尔（L/mol）。在RIA中，K是该抗血清能达到的最小检出量（灵敏度）的倒数，K=1/H，H是最小检出量，通常，K的范围在1081012L/mol之间。,单克隆抗体技术,单克隆抗体：由B细胞杂交瘤产生的只识别抗原分子上一种抗原决定簇的抗体分子。,杂交瘤技术的原理及流程,HAT培养基是含有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸的完全培养基。在氨基蝶呤(二氢叶酸类似物)存在下，这种酶缺陷的细胞不能通过核苷酸合成旁路合成次黄嘌呤和胸苷。制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖
17、转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于二周内均死亡。PEG：聚乙二醇,单克隆抗体的特性,高度均一性 纯度很高的均一性抗体高度专一性 只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应 大量产生及稳定性 杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖并传代,基因工程抗体(Genetic engineering antibody),根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞
18、进行表达，产生新型抗体。主要包括 嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。,一. 嵌合抗体(chimeric antibody),从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。,二. 单链抗体(single chain antibody),用基因工程方法，将抗体重链和轻链可变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋白。 特点：能保持与抗原结合的性能，分子量小，穿透性强，体内循环半衰期短，免疫原性低。,三. 人源化抗体(humanized antibody),1. 将小鼠的CDR（互补决定区）序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体。2.将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体。,小结,抗血清的制备及纯化单克隆抗体的制备基因工程抗体技术,作业,1、抗原2、半抗原3、载体4、单克隆抗体5、试述针对食品中抗生素残留的多克隆抗体制备的流程。,
